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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » ORF老是扩不出来
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mengmenglu

金虫 (小有名气)

[求助] ORF老是扩不出来

各位大虾，最近遇到点问题。之前扩全长已扩完，最近做表达，要把ORF片段连到PET载体上。根据ORF设计了引物，上游引物GC含量比较低，只有25%。用此引物扩CDNA时，片段大小符合，回收，连接，转化后测序，发现测序结果只有其中一条引物匹配，要么上游引物，要么下游引物，除此之外其他的碱基都不能匹配。做了好多次了，都扩不出来。后来又用了 LA Taq酶，也不行。谁能给支支招啊，这一个表达做了好几个月了，就在ORF这里卡住了。可以肯定的是ORF序列没问题。
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1楼 2011-08-22 18:52:16
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camen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
mengmenglu(金币+1): 2011-08-22 22:25:31
看天(金币+3): 新人鼓励 2011-08-23 08:28:43
mengmenglu(金币+1): 谢谢 2011-09-09 17:00:48
mengmenglu(金币+3): 2011-10-07 17:47:05
最大可能就是你引物有问题，如果你从基因组里扩增，很可能是出现了错配。
你的PCR产物跑胶时又没有杂带或者弥散？
首先调整PCR条件，看能不能得到特异性产物。
不行的话重新设计引物
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2楼2011-08-22 21:42:17
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mengmenglu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by camen at 2011-08-22 21:42:17:
最大可能就是你引物有问题，如果你从基因组里扩增，很可能是出现了错配。
你的PCR产物跑胶时又没有杂带或者弥散？
首先调整PCR条件，看能不能得到特异性产物。
不行的话重新设计引物

我的引物是根据ORF序列来设计的，一头一尾，都加了酶切位点的，没办法改变了，每次PCR扩增都有条带，而且条带大小也符合，也没有什么非特异性条带。但是回收后连接转化测序就得不到想要的东西。可能只能再优化PCR条件了。谢谢你！
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3楼2011-08-22 22:28:48
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780871756

新虫 (初入文坛)
我也是这样啊，，，，
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aa
4楼2011-10-18 12:47:25
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wlwabcd

铜虫 (正式写手)
同求！我的5'端是GCrich区，3'端是ATrich区。有没有什么好办法可以解决。推荐几个好点的酶也可以，谢谢！
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5楼2011-10-18 15:47:41
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jasco

木虫 (正式写手)
有个复杂点的办法：
分析序列，看看能不能找到合适的酶切微点，分成两段做，先扩一段并放入pet载体得到一个中间载体，然后再扩后面一段再放入中间载体
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6楼2011-10-19 21:59:46
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mengmenglu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by wlwabcd at 2011-10-18 15:47:41:
同求！我的5'端是GCrich区，3'端是ATrich区。有没有什么好办法可以解决。推荐几个好点的酶也可以，谢谢！

我的已经解决了。经分析，是引物的问题。之前我的上下游引物都是20bp的，后来我把上下游引物均增加到30bp，一次性搞定，现在表达都要做完了。呵呵，大伙，加油啊！
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7楼2011-10-21 20:17:06
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mengmenglu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 780871756 at 2011-10-18 12:47:25:
我也是这样啊，，，，

你也重新设计引物试试吧。
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8楼2011-10-21 20:17:43
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曦曦木语

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by mengmenglu at 2011-10-21 20:17:06
我的已经解决了。经分析，是引物的问题。之前我的上下游引物都是20bp的，后来我把上下游引物均增加到30bp，一次性搞定，现在表达都要做完了。呵呵，大伙，加油啊！...

我遇到了相同的问题，不过我的引物都30多bp了，每次都有条带，但是就是连不上载体，心好累
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9楼2018-01-13 13:47:53
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