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渭水凡夫

铁虫 (小有名气)

[求助] 求解读此PCR 为何如此不堪入目

求解读此PCR 为何如此不堪入目
求解读此PCR 为何如此不堪入目
2013-5-23晚上PCR1.JPG
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平静的水和不叫的狗是最可怕的
1楼 2013-05-23 22:36:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

wenzi6337

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 鼓励发帖交流 2013-05-25 08:56:29
模板的纯度也要考虑，杂质是否抽提干净，多糖比蛋白难去除。做一个降落PCR，看看效果是否会好一点。
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12楼2013-05-24 22:20:45
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普通回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 鼓励发帖交流 2013-05-24 07:35:21
多半是反应体系里面模板的浓度太高了.
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2楼2013-05-23 23:04:30
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渭水凡夫

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-23 23:04:30
多半是反应体系里面模板的浓度太高了.

前面五个是1ul 后面五个是0.5ul的模板量  我觉得不是很多  有没有那种情况就是根本没有模板DNA呢？
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平静的水和不叫的狗是最可怕的
3楼2013-05-23 23:54:23
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不像. 你不能凭体积判断模板是不是加多了, 需要考虑的是最终在PCR反应体系里面模板浓度.
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4楼2013-05-24 00:09:32
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渭水凡夫

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by bullfrog325 at 2013-05-24 00:09:32
不像. 你不能凭体积判断模板是不是加多了, 需要考虑的是最终在PCR反应体系里面模板浓度.

但是我提的模板样用凝胶电泳检测啥都没有啊就才做PCR看看 结果出了个这图
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平静的水和不叫的狗是最可怕的
5楼2013-05-24 00:26:07
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阿树的秋天

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 鼓励发帖交流 2013-05-25 08:57:06
太笼统了  PCR有很多限制因素 如退火温度 延伸时间 以及楼上诸位兄弟姐妹说的浓度 另外还有引物特异性的问题  电泳缓冲液有问题也会导致这些问题 一个个找吧
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6楼2013-05-24 09:44:40
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lixinglin

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-05-25 08:57:15
可以用Nanodrop检测下DNA的浓度及纯度看看，有时候DNA质量不好也会有影响的
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7楼2013-05-24 09:57:12
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匿名

用户注销 (小有名气)
★
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-05-25 08:57:28
本帖仅楼主可见
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8楼2013-05-24 10:42:30
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渭水凡夫

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by β内酰胺 at 2013-05-24 10:42:30
同意，PCR的限制因素太多了，模板（浓度和里面是不是有什么抑制物），引物是不是有问题，dNTP浓度，Mg2+浓度，退火温度，甚至酶的量

PCR:  25ul
第一轮
mix      12.5
F:        0.5
R:        0.5
模板    3ul
ddH2O 8.5UL
第二轮
mix      12.5
F:        0.5
R:        0.5
模板    0.5ul/1ul
ddH2O   11UL/10.5ul

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平静的水和不叫的狗是最可怕的
9楼2013-05-24 10:47:24
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bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

从楼主给的条件看, 第二轮PCR模板应该需要稀释, 你把它稀释100倍再用0.5或者1微升作为第二轮PCR的模板.
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10楼2013-05-24 15:14:46
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