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高照李木虫 (正式写手)
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求解PCR问题《忘记加水的前后》
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我要扩增昆虫线粒体DNA的一个片段，前天做退火温度的梯度PCR实验时时侯忙中出错忘记加水了（需定容至50微升），扩出的结果用琼脂糖凝胶电泳检测时发现有3 个温度的样本有片段（40-52度的梯度，41.6度、48度和50度的有，41.6度的最亮），且和需要的大小相近，其它温度的样本则没有扩出。我又重新做了一遍退火温度的梯度PCR（所有试剂都加好了无遗漏），但什么也没出。 请问这是什么原因？请问哪位大侠知道。 |
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zhaodahe
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11楼2012-11-23 12:06:14
reallpf
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2楼2012-11-22 20:15:36
高照李
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多谢学长回复，我这两天有重做了，温度梯度还是没做出来，模板浓度梯度、酶浓度梯度也做了还是没出。引物空白对照也做了，引物没问题。我做的是几种昆虫的DNA线粒体DNA COI片段，目的基因大小约600-700bp,用pcr扩增COI片段，50μl的扩增反应体系是： Premix Ex Taq 25μl 引物1（LCO1490)（20μM）1μl 引物2 (HCO2198)（20μM）1μl 模板1μl（<50ng）1μl 灭菌蒸馏水 22μl PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性60s，50℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环，循环结束后，72℃延伸10min。 麻烦您能否帮我看一下，有可能是哪出的问题？ |
3楼2012-11-22 23:09:23
高照李4楼2012-11-22 23:18:32