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所谓医人z

铜虫 (初入文坛)

[求助] 新手求助关于逆转录PCR问题 已有3人参与

在下本科生一名,刚刚开始做创新实验,实验方法设计逆转录PCR等。想请教一下大侠们关于引物设计相关问题。
用primer 设计软件设计出来的上下游引物按道理应该是一个与已知mRNA相应序列互补,一个与已知mRNA相应序列相同吧?那么最后扩增的cDNA序列一半与已知mRNA相同,一半与已知mRNA互补吧?但是将PCR产物测序结果拿到NCBI进行BLAST后发现,上下游序列都是一样的呀?请各位前辈指导!拜谢
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gu666hong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
所谓医人z(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-08 16:36:20
一般上游引物和mRNA是互补,下游是一样的。引物设计上下游的引物很多是反向互补的,blast的是cDNA文库,

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
2楼2014-06-08 01:25:44
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gu666hong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

忘了说测序回来的他也只是读的cDNA那一条链,不是两条链。PCR产物测序只是从上下游读取一条有效链给你结果

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2014-06-08 01:30:58
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-06-08 02:48:37
内容已删除
4楼2014-06-08 02:13:07
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2014-06-08 02:49:04
“上下游序列都是一样的”,这才是正常的。PCR产物测序都是从5'端进行的,正向和反向测序是指对DNA的两条互补链分别测序,通常两个方向测序结果经校读后完全一致才能认为得到可靠结果。
5楼2014-06-08 02:39:03
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
所谓医人z(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-08 16:36:52
BLAST检测本来就考虑互补问题,2个互补的序列算是序列一致
6楼2014-06-08 09:51:45
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所谓医人z

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gu666hong at 2014-06-08 01:25:44
一般上游引物和mRNA是互补,下游是一样的。引物设计上下游的引物很多是反向互补的,blast的是cDNA文库,

万分感谢~请问这方面有什么书籍可以参考吗?

[ 发自小木虫客户端 ]
7楼2014-06-08 11:16:51
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所谓医人z

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-06-08 02:13:07
逆转录使用的是随机引物,一种长度为 6~10 个核苷酸,由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。它们可以在 mRNA 的不同位点结合,合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。这种杂交体一般不能构建载体,必须把这种杂交体中的 RNA ...

也就是说,逆转录以后做PCR扩增时,它的扩增模板有两条链?

[ 发自小木虫客户端 ]
8楼2014-06-08 11:20:35
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所谓医人z

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by gu666hong at 2014-06-08 01:25:44
一般上游引物和mRNA是互补,下游是一样的。引物设计上下游的引物很多是反向互补的,blast的是cDNA文库,

但是Primer Premier5.0设计引物后输出结果是上游与相应的mRNA一样而下游互补呀?

[ 发自小木虫客户端 ]
9楼2014-06-08 11:23:50
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gu666hong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你用ncbi查到的序列就是cDNA,你把它输入到primer 里设计肯定是一样的啊。你看你用来设计引物的序列是agct还是agcu..

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
10楼2014-06-09 22:51:15
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