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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 新手求助关于逆转录PCR问题
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所谓医人z

铜虫 (初入文坛)

[求助] 新手求助关于逆转录PCR问题 已有3人参与

在下本科生一名，刚刚开始做创新实验，实验方法设计逆转录PCR等。想请教一下大侠们关于引物设计相关问题。
用primer 设计软件设计出来的上下游引物按道理应该是一个与已知mRNA相应序列互补，一个与已知mRNA相应序列相同吧？那么最后扩增的cDNA序列一半与已知mRNA相同，一半与已知mRNA互补吧？但是将PCR产物测序结果拿到NCBI进行BLAST后发现，上下游序列都是一样的呀？请各位前辈指导！拜谢
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1楼 2014-06-08 00:16:24
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gu666hong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
所谓医人z(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-08 16:36:20
一般上游引物和mRNA是互补，下游是一样的。引物设计上下游的引物很多是反向互补的，blast的是cDNA文库，

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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2楼2014-06-08 01:25:44
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gu666hong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

忘了说测序回来的他也只是读的cDNA那一条链，不是两条链。PCR产物测序只是从上下游读取一条有效链给你结果

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2014-06-08 01:30:58
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-08 02:48:37
内容已删除
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4楼2014-06-08 02:13:07
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Lau_Kimura

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2014-06-08 02:49:04
“上下游序列都是一样的”，这才是正常的。PCR产物测序都是从5'端进行的，正向和反向测序是指对DNA的两条互补链分别测序，通常两个方向测序结果经校读后完全一致才能认为得到可靠结果。
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5楼2014-06-08 02:39:03
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jurkat.1640

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
所谓医人z(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-06-08 16:36:52
BLAST检测本来就考虑互补问题，2个互补的序列算是序列一致
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6楼2014-06-08 09:51:45
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所谓医人z

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gu666hong at 2014-06-08 01:25:44
一般上游引物和mRNA是互补，下游是一样的。引物设计上下游的引物很多是反向互补的，blast的是cDNA文库，

万分感谢～请问这方面有什么书籍可以参考吗？

[ 发自小木虫客户端 ]
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7楼2014-06-08 11:16:51
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所谓医人z

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Lau_Kimura at 2014-06-08 02:13:07
逆转录使用的是随机引物，一种长度为 6~10 个核苷酸，由 4 种碱基随机组成的 DNA 片段。它们可以在 mRNA 的不同位点结合，合成的产物也是 RNA-DNA 的杂交体。这种杂交体一般不能构建载体，必须把这种杂交体中的 RNA ...

也就是说，逆转录以后做PCR扩增时，它的扩增模板有两条链？

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8楼2014-06-08 11:20:35
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所谓医人z

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gu666hong at 2014-06-08 01:25:44
一般上游引物和mRNA是互补，下游是一样的。引物设计上下游的引物很多是反向互补的，blast的是cDNA文库，

但是Primer Premier5.0设计引物后输出结果是上游与相应的mRNA一样而下游互补呀？

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9楼2014-06-08 11:23:50
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gu666hong

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先你用ncbi查到的序列就是cDNA，你把它输入到primer 里设计肯定是一样的啊。你看你用来设计引物的序列是agct还是agcu..

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10楼2014-06-09 22:51:15
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