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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR实验操作过程中遇到的问题
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821078607

银虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR实验操作过程中遇到的问题 已有1人参与

各位实验高手大家好！
    PCR菜鸟请教大家一个小问题，我采用RT-PCR做半定量测定时一般平行做三分样品，最后扩增的三条曲线不怎么重合，有时差别还很大。我一般加完样后，用枪头混合样品15下左右，最后枪头上可能会残留点点样品。
    请问大家有没有遇到三条线不重合这个问题，有什么好的建议和意见吗？还有大家加完样后需不需要用枪头混合均匀？
    期待大家的答复，先谢谢各位！
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1楼 2013-01-02 15:10:53
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gaoyang636

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
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821078607: 金币+4 2013-01-03 17:19:55
你这个三分样品是怎么个意思？比如取自三个不同的个体，的确很有可能不重合啊，个体差异性对实验结果影响很大的。
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2楼2013-01-02 18:09:27
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821078607

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gaoyang636 at 2013-01-02 18:09:27
你这个三分样品是怎么个意思？比如取自三个不同的个体，的确很有可能不重合啊，个体差异性对实验结果影响很大的。

取自同一个样品也不重合
请问你一般是怎么操作的
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3楼2013-01-02 19:39:50
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红果子1987

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
20ul体系，我是试剂混合均匀，先加18ul的混合液，再加2ul模板，轻轻离心一下就可以了。
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4楼2013-01-02 19:45:17
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mlanqiang

木虫之王 (文学泰斗)

蓝博士

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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821078607: 金币+3 2013-01-03 17:19:37
会的，应该是很不均匀造成的。
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蓝精灵
5楼2013-01-02 20:01:57
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821078607

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 红果子1987 at 2013-01-02 19:45:17
20ul体系，我是试剂混合均匀，先加18ul的混合液，再加2ul模板，轻轻离心一下就可以了。

我一般也是20uL体系，现加18混合液，再加2ul的模板，我会先用枪混合之后，再进行离心，可是出来的曲线不重合还有的差很多，你离心前有没有用枪吹打混匀，还是直接加了离心就可以？
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6楼2013-01-02 22:02:49
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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6楼: Originally posted by 821078607 at 2013-01-02 22:02:49
我一般也是20uL体系，现加18混合液，再加2ul的模板，我会先用枪混合之后，再进行离心，可是出来的曲线不重合还有的差很多，你离心前有没有用枪吹打混匀，还是直接加了离心就可以？...

加入模板之后一般不用混匀 离心确保都下去了就行
第一步变性九十几度一下就都匀了 多混一步更增加了试剂挂壁的量
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7楼2013-01-02 23:33:25
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
821078607: 金币+5 2013-01-03 17:19:22
一般一个样品三个复孔差一个循环以内都正常 平均一下就行了 试剂啊加样啊仪器啊都会有误差的 要不然也就没必要做复孔了
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8楼2013-01-02 23:37:17
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小白虾

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
821078607: 金币+2 2013-01-03 17:19:06
只要做内参一切都OK啦，曲线的影响因素很多
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飞的更高
9楼2013-01-03 00:07:44
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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平行做三分样品，你是每一步都是分开加的吗？还是事先都混好了，只是在最后一步向PCR板点样的时候，分别点3个样？如果是前者，出现曲线不重合很正常，如果是后者，一般是你的加样枪有问题，或者机器有问题。
另：单一样品三条曲线是否重合，和有没有内参以及标准曲线没有关系。
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生活是美好的
10楼2013-01-03 16:04:24
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