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821078607

银虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by nuoyaeva at 2013-01-03 16:04:24
平行做三分样品,你是每一步都是分开加的吗?还是事先都混好了,只是在最后一步向PCR板点样的时候,分别点3个样?如果是前者,出现曲线不重合很正常,如果是后者,一般是你的加样枪有问题,或者机器有问题。
另:单 ...

先混好了,最后加的样品,加完样后用枪头吹打混合10-20下,枪头上会有残留,如果不混又担心样品不均匀也会引起大的差异,所以请教一下你是怎么进行加样操作的。
11楼2013-01-04 10:38:38
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你尝试配制一管60 μl的反应,然后分成3管,每管20 μl,看看是否是仪器的问题
因为如果是ABI的仪器,管间差异还是挺大的

另外一个疑问,你用实时为啥做半定量?
12楼2013-01-04 11:10:54
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wcg129

禁虫 (著名写手)

本帖内容被屏蔽

13楼2013-01-04 15:29:10
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 821078607 at 2013-01-04 11:38:38
先混好了,最后加的样品,加完样后用枪头吹打混合10-20下,枪头上会有残留,如果不混又担心样品不均匀也会引起大的差异,所以请教一下你是怎么进行加样操作的。...

加完样后用枪头吹打混合10-20下?你不是已经混好了吗?就直接向PCR板加样啊,已经混匀之后就不要再吹打了,尤其是在反应板里。
如果你担心枪头残留问题,你可以稍微多吸一点,然后点样的时候,加样枪推到第一个stop的时候就行了,不要推到第二个stop把所有液体都打出来,这样你三次加的液体量就一定是均等的了,而且也排除了气泡的影响。
再就是问下,你每次CT值相差多少?
生活是美好的
14楼2013-01-05 09:47:48
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monica1989

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
14楼: Originally posted by nuoyaeva at 2013-01-05 09:47:48
加完样后用枪头吹打混合10-20下?你不是已经混好了吗?就直接向PCR板加样啊,已经混匀之后就不要再吹打了,尤其是在反应板里。
如果你担心枪头残留问题,你可以稍微多吸一点,然后点样的时候,加样枪推到第一个st ...

你好,看到你的帖子回复,我在real timePCR加样过程中也遇到了相同的问题,即复孔对照间的Ct值相差较大,会超过0.5,所以想请教下,
第一,在混合好的体系里面加入模板时,可以不用枪头吹打混匀?
第二,加模板用一档吸二档打,能够加得准吗?(涉及一个样本多个基因的检测,二档吸一档打会浪费较多的模板)
第三,加模板时,你的枪头的位置是怎么控制的了?
非常感谢!
脚踏实地 活在当下
15楼2014-05-15 15:17:20
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水舞清荷

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by monica1989 at 2014-05-15 15:17:20
你好,看到你的帖子回复,我在real timePCR加样过程中也遇到了相同的问题,即复孔对照间的Ct值相差较大,会超过0.5,所以想请教下,
第一,在混合好的体系里面加入模板时,可以不用枪头吹打混匀?
第二,加模板用 ...

二挡吸一档打的话对枪的伤害是不是很大,我每次也是反复吹打好多次,总感觉吹打多次跟一次性吸得量不一样多,CT值差的挺大,该怎么解决
云淡,风清,心自安
16楼2016-03-22 11:38:31
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