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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR实验操作过程中遇到的问题
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821078607

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by nuoyaeva at 2013-01-03 16:04:24
平行做三分样品，你是每一步都是分开加的吗？还是事先都混好了，只是在最后一步向PCR板点样的时候，分别点3个样？如果是前者，出现曲线不重合很正常，如果是后者，一般是你的加样枪有问题，或者机器有问题。
另：单 ...

先混好了，最后加的样品，加完样后用枪头吹打混合10-20下，枪头上会有残留，如果不混又担心样品不均匀也会引起大的差异，所以请教一下你是怎么进行加样操作的。
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11楼2013-01-04 10:38:38
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txw87

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你尝试配制一管60 μl的反应，然后分成3管，每管20 μl，看看是否是仪器的问题
因为如果是ABI的仪器，管间差异还是挺大的

另外一个疑问，你用实时为啥做半定量？
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12楼2013-01-04 11:10:54
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wcg129

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
13楼2013-01-04 15:29:10
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nuoyaeva

铁杆木虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 821078607 at 2013-01-04 11:38:38
先混好了，最后加的样品，加完样后用枪头吹打混合10-20下，枪头上会有残留，如果不混又担心样品不均匀也会引起大的差异，所以请教一下你是怎么进行加样操作的。...

加完样后用枪头吹打混合10-20下？你不是已经混好了吗？就直接向PCR板加样啊，已经混匀之后就不要再吹打了，尤其是在反应板里。
如果你担心枪头残留问题，你可以稍微多吸一点，然后点样的时候，加样枪推到第一个stop的时候就行了，不要推到第二个stop把所有液体都打出来，这样你三次加的液体量就一定是均等的了，而且也排除了气泡的影响。
再就是问下，你每次CT值相差多少？
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生活是美好的
14楼2013-01-05 09:47:48
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monica1989

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by nuoyaeva at 2013-01-05 09:47:48
加完样后用枪头吹打混合10-20下？你不是已经混好了吗？就直接向PCR板加样啊，已经混匀之后就不要再吹打了，尤其是在反应板里。
如果你担心枪头残留问题，你可以稍微多吸一点，然后点样的时候，加样枪推到第一个st ...

你好，看到你的帖子回复，我在real timePCR加样过程中也遇到了相同的问题，即复孔对照间的Ct值相差较大，会超过0.5，所以想请教下，
第一，在混合好的体系里面加入模板时，可以不用枪头吹打混匀？
第二，加模板用一档吸二档打，能够加得准吗？（涉及一个样本多个基因的检测，二档吸一档打会浪费较多的模板）
第三，加模板时，你的枪头的位置是怎么控制的了？
非常感谢！
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脚踏实地 活在当下
15楼2014-05-15 15:17:20
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水舞清荷

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by monica1989 at 2014-05-15 15:17:20
你好，看到你的帖子回复，我在real timePCR加样过程中也遇到了相同的问题，即复孔对照间的Ct值相差较大，会超过0.5，所以想请教下，
第一，在混合好的体系里面加入模板时，可以不用枪头吹打混匀？
第二，加模板用 ...

二挡吸一档打的话对枪的伤害是不是很大，我每次也是反复吹打好多次，总感觉吹打多次跟一次性吸得量不一样多，CT值差的挺大，该怎么解决
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云淡，风清，心自安
16楼2016-03-22 11:38:31
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