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swj11123

新虫 (小有名气)

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专业: 植物生理与生化

[求助] 有没有关于植物RT-PCR的详细步骤

有没有关于植物RT-PCR实验的详细步骤比如RNA的提取，序列该上什么网站下载来辅助设计引物，RT-PCR的仪器又该如何操作的因为我是第一次做所以步骤越详细越好拜托大家啦

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1楼2012-09-14 20:58:36

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yewenxing

新虫 (初入文坛)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
swj11123: 金币+3, ★有帮助, 谢谢啦但有没有专门针对植物的呀植物 2012-09-18 09:08:19
gyfgood: 金币+10, APEPI+1, 应助指数+1, 很详细，很有帮助！ 2012-09-26 12:39:35
swj11123: 金币+5, ★有帮助 2012-09-26 20:56:16
swj11123: 金币+7, ★★★★★最佳答案 2012-10-20 10:20:23

RT-PCR实验步骤
一．实验器具：
1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl
2.吸头：1ml、200μl、20μl
3.匀浆管：5ml
4.EP管：1.5ml、500μl、200μl
5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)
6.量筒：100ml
7.容量瓶：1000ml
8.试管架：5ml、1.5ml、20μl
9.铝制饭盒：1-2个
10.大瓷缸：1个
11.锡泊纸：一卷
12.卷纸：2卷
13.三角烧瓶：带盖，稍大

二．实验器具处理
1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制
品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：
DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和
匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果DEPC处理过的物品时
间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。
2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。
3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DEPC)。

三．试剂配制
1．DEPC水：吸出1mlDEPC放在1000ml容量瓶中加双蒸水定容至1000ml，配成1‰DEPC水，
并充分振荡混匀备用。
2．75%乙醇：用无水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(DEPC水需先高压，高压时注意：1.
装DEPC水的瓶子在盖子和瓶之间要放上线头；2.高压时间在40-45分钟，所以水要适当多加一
点；3.高压结束后，不要强行放气，要让压力自然下降，不然水会喷出)。
3．异丙醇：放入棕色瓶中。
4．氯仿：放入棕色瓶中。
5．琼脂糖

四．缓冲液配制

1．电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris

54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA

20ml pH8.0、加

蒸溜水至1000ml。使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度)
2．上样缓冲液(6×缓冲液，4℃保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油

五．琼脂糖凝胶配制
1．1.0%：1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮
透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60℃时加入10mg/ml溴化乙锭2.5μl，充分混
匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4度冰箱加快琼

脂糖凝固)后现进行电泳。
2．1.5%:同上，将琼脂糖的量改为1.5g

六．需购置材料
Taq酶(-20度保存)(配10×buffer和MgCl2)：不需要使用高保真Taq酶，一般的就行。个
人感觉天为时代的普通Taq酶就很不错。
dNTP(4度保存)：向生物公司购买，原装和分装均可。
oligo(dT)15(-20度保存)：可以向生物公司购买Invitrogen合成的廉价货，每支10元，稀
释后使用(注意稀释浓度)，也可以购买Promega的原装货，稀释10倍后使用，稀释液4度保存。
M-MLV(-20度保存)：向生物公司购买，推荐使用Promega的，当然有钱可以购买更好的AMV。
RNasin(-20度保存)：向生物公司购买，推荐使用Promega的，原装分装均可。
DEPC(4度保存)：向生物公司购买，5克足矣。
Trizol(4度保存)：有50ml和100ml规格，按照实验需要自己购买。国外进口的有
Invitrogen(Trizol)、罗氏(TriPure)、MRC(TriReagent)；国内的也行，天为时代的就不错。
Marker(4度保存)：按照目的条带大小购买，推荐使用天为时代的Marker(物美价廉，上样
2.5ul就很亮了，较3.0ul的Takara同样品种Marker为亮)，本人很喜欢它的DL2000。
电泳LoadingBuffer(4度保存)：按照配方自己配制，不需要购买(购买的话价格挺贵)。

七．引物合成
1．内参照：GAPDH(452bp)正义：5-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3
反义：5-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3
2．退火温度计算：2(A+T)+4(G+C)，正反义平均数，再上下波动4-5度。
3．引物2 OD已足够，每管1 OD分装。
4．引物稀释：加DEPC水量(μl)＝Xnmol/OD(合成的引物管上有标注)×管上所标OD数(推
荐每管引物为1 OD分装，合成之前向公司说明这一点，切记！！)×100。最终引物浓度为10pmol
/μl。

八．PCR产物电泳
取1-10μl(一般取5μl)PCR产物，加已点在纸上的6×上样缓冲液，反复吸打混匀后进行电泳，
一般用稳压状态进行电泳，100V左右，电泳20-30分钟，紫外灯下观察，结果进行扫描保存。

九．注意点：1逆转录后应立即冰水浴2RNA抽提前，打开离心机预冷

TRIzol 法抽提总 RNA

组织100mg/细胞1×107

↓
加1mlTRIzol
↓
组织：匀浆(彻底，分几次打，是匀浆时产生的热量能散出，后转至EP管)
细胞：用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓

加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5)
↓
颠倒混匀10下，室温5分钟
↓
4℃，离心12000g，15分钟
↓
转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中
↓
加等体积异丙醇(约400μl)，混匀室温10分钟
↓
4℃，离心12000g，10分钟
↓
弃上清
↓
加冰预冷的75%乙醇(DEPC水配)1ml
↓
4℃离心7500g，5分钟
↓
弃上清，空气干燥5-10分钟(不能完全干燥)
↓
溶于DEPC水中

注意：1.RNA若用于核酸转移应溶解于样本缓冲液中，否则DEPC溶解。
2.细胞组织加TRIzol匀浆后，可在-60℃放置至少一个月(甚至可一年以上)。
3.RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年。
4.弃上清的操作，我们一般将EP管倒置在平铺于桌面的卷纸上，吸干。
5.最后一步弃酒精，将RNA溶于DEPC水的操作，我们的做法是：先按4的步骤吸干酒精，其实
这样还是不彻底的，再将EP管小离心后用20μl小枪头(DEPC处理过的)吸出多余的酒精。最后
用200μl中枪头(DEPC处理过的)吸11.5μl(20μl体系，如果是40μl体系则加倍)的DEPC水
至EP管中，吹打助溶，然后转移至200μl的EP管(这些EP管中可以事先加好Oligo(dT)15，以
节省枪头)中。

两步法 RT-PCR

(第一步：逆转录反应：20μl体系，如果是40μl体系则加倍)

试剂
RNA
Oligo(dT)15

浓度

0.05μg/μl

体积
11.5μl
2μl

终浓度

0.005μg/μl

(0.05μg/μlOligo(dT)15为Oligo(dT)15原液稀释10倍的浓度)
↓
混匀，离心，70℃5min
↓
立即冰水浴，稍离心
↓

试剂
M-MLVBuffer
dNTP
RNasin
M-MLV

浓度
5×
10mM
40U/μl
200U/μl

体积
4μl
1μl
0.5μl
1μl

终浓度
1×
0.5mM
20μ
200U

总体积20μl
↓
混匀，离心，42℃60min
↓
95℃10min(破坏M-MLV)
↓
4℃保存

(第二步：PCR反应：总体积20μl，如果50μl体系，相应加倍)

试剂
TaqBuffer
MgCl2
dNTP
上游引物
下游引物
cDNA模板
DEPC水
Taq酶

浓度
10×
25mM
10mM
10pmol/μl
10pmol/μl

2.5U/μl

体积
2μl
1.2μl
0.2μl
0.4μl
0.4μl
1μl
14.7μl
0.1μl

终浓度
1×
1.5mM

↓
混匀
↓

95℃
94℃
X℃
72℃
72℃

5分
30秒
30-40秒
30秒
7分

预变性
变性
退火
延伸
终末延伸

(28-36循环，4℃保存)

注意：1.Taq酶、M-MLV、Rnasin等-20℃保存，操作时置于冰上。
2.dNTP保存在4度即可，勿反复冻融。
3.如果一次做很多管，可以先将共同需要的部分一起加(稍微多算一点，例如20管分装，可以加
入21-22管的量，因为枪头会吸附一定的液体，可能有人认为这样会浪费试剂，其实不然，因为
每管分开加的话试剂用量更多，枪头吸附的试剂的量其实也是很可观的，特别是国产的枪头，这
样做同时还能降低加样误差)，然后各管分装，再加各自不同的部分。
4.如果200μl的EP管在PCR过程中盖子容易炸开，解决方法有：(1)用封口膜将管口密封、(2)
最后每管加入液体石蜡进行液封。

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swj11123

2楼2012-09-17 21:33:49

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小木虫刘树青

木虫 (著名写手)

夜未眠

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【答案】应助回帖

楼上说的很详细!

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世界上只有一种真正的英雄主义，那就是看清生活的真相之后，依然热爱生活。

3楼2012-09-18 18:44:16

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swj11123

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引用回帖:

2楼: Originally posted by yewenxing at 2012-09-17 21:33:49
RT-PCR实验步骤
一．实验器具：
1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl
2.吸头：1ml、200μl、20μl
3.匀浆管：5ml
4.EP管：1.5ml、500μl、200μl
5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇)
6.量筒：1 ...

谢谢啦但是有个问题在加哪内参引物和样品引物是不是加在不同管的

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4楼2012-09-26 08:25:36

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