应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR模板RNA逆转录为CDNA后，CT值过大
81/1返回列表
查看: 4247  |  回复: 7
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

daisyhappy

铜虫 (小有名气)

[求助] QPCR模板RNA逆转录为CDNA后，CT值过大

请教大家一个问题，由于试剂盒中的标准品是RNA，但是这个不好保存太不稳定易降解，所以我现在讲其全部一次性逆转录成CDNA，想用这个作为标准品进行定量。但是将CDNA进行梯度稀释以后，发现CT值偏大，一般在28以后，最大的到38，根本无法准确定量。电泳检测还是有产物的。想请问大家：
1.有没有好的方法解决这种标准品是RNA的问题？或者溶在乙醇里面保存？
2.我开始做的几次QPCR复孔重复性挺好的，但是现在做总是重复性不好。不知道哪里出了问题？我用的试剂等分别是一个厂家的，但是不同的试剂盒。
请大家帮忙分析，谢谢！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-10 10:51:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
试剂盒里面的标准品是否浓度较高，如果本身就不高，那么你反转录过来后肯定浓度也不高，还有你反转录效果如何
赞一下 回复此楼
2楼2012-12-10 14:57:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

daisyhappy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2012-12-10 14:57:13
试剂盒里面的标准品是否浓度较高，如果本身就不高，那么你反转录过来后肯定浓度也不高，还有你反转录效果如何

标准品的浓度是不太高的。反转效果还可以的啊。
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-10 17:27:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by daisyhappy at 2012-12-10 17:27:39
标准品的浓度是不太高的。反转效果还可以的啊。...

那么你问下厂家标准品浓度Ct值大概在哪儿不就明白了么
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-11 14:12:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

daisyhappy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by love_st at 2012-12-11 14:12:23
那么你问下厂家标准品浓度Ct值大概在哪儿不就明白了么...

这个我是知道的啊。我开始做的几次和后来做的几次的CT值有一些差别，所以我觉得是降解了。现在的问题是怎么更好的保存和解决RNA作为标准品不稳定容易降解的问题。还有怎么保证良好的重复性。有没有好的建议和方法没？
赞一下 回复此楼
5楼2012-12-12 12:39:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by daisyhappy at 2012-12-12 12:39:14
这个我是知道的啊。我开始做的几次和后来做的几次的CT值有一些差别，所以我觉得是降解了。现在的问题是怎么更好的保存和解决RNA作为标准品不稳定容易降解的问题。还有怎么保证良好的重复性。有没有好的建议和方法没 ...

试剂盒里一般都不建议你反复冻融，特别是标准品如果是RNA的话，反复冻融肯定浓度多少会降低，良好的重复性是建立在你的良好的操作习惯，操作手法上面的。没有好的建议。
赞一下 回复此楼
6楼2012-12-12 16:57:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

feixiang1209

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

CT超过30一般都不是好结果了，很有可能是引物二聚体了。你做no cmplete control了吗？对比一下，我觉得扩增的很可能是引物二聚体。至于原因，可能是RNA降解了或者反转录后浓度太低了。
RNA那么容易降解怎么会把RNA做成标准品呢，运输过程怎么保证呢？就算保证了也就放一个月左右。想不通
赞一下 回复此楼
7楼2013-05-07 21:12:18
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

rna逆转录前。1.看下电泳确定rna的质量。2.如果确定是rna标准品。冰上操作和尽量减少操作时间是关键。3.模板的量不能太多。cdna模板的浓度控制在2ng左右比较好。4pcr体系，这个条件都要摸得。~
赞一下 回复此楼
应助之星就是我~没错。你没有看错~
8楼2013-11-04 13:19:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 daisyhappy 的主题更新
81/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 生命口面上会评结束了吗大家有知道结果吗？现在还没有结果正常不？ +4 碧水00 2026-07-16 6/300 2026-07-16 08:11 by gltch
[基金申请] 生生命学部会评 +4 wuke100666 2026-07-15 4/200 2026-07-16 00:12 by 啦啦小妮子
[有机交流] 伯胺上甲基求助 100+4 002tmumu 2026-07-14 4/200 2026-07-15 22:01 by 学员oN9JQD
[基金申请] H口，面上，时间戳7月7日。 +3 plumage5 2026-07-15 3/150 2026-07-15 21:06 by 6543yes
[基金申请] 小木虫没落了，除了祈祷帖子，几乎看不到有价值的帖子 +13 botar 2026-07-14 14/700 2026-07-15 19:28 by 寒流32
[基金申请] 会评 +5 无名者登山 2026-07-15 5/250 2026-07-15 18:15 by 杠就是你对
[基金申请] E口会评 +11 布布和一二 2026-07-13 13/650 2026-07-15 16:34 by Kittylucky
[基金申请] E口青C会评结束了吗？ 40+3 小小书虫c 2026-07-14 9/450 2026-07-15 16:04 by 安静的知了
[基金申请] 生命口C13面上会评时间 +6 luckinging 2026-07-14 9/450 2026-07-15 14:39 by 雨冰共舞
[教师之家] 内心匮乏 +13 水冰月月野兔 2026-07-12 13/650 2026-07-15 14:21 by jiduquegai
[文学芳草园] 你可曾有过这种感受？ +3 Jeanya 2026-07-09 6/300 2026-07-15 11:07 by mbtwt
[论文投稿] 农业机械学报投稿周期 +3 G0DLIN 2026-07-14 7/350 2026-07-15 09:26 by xs74101122
[基金申请] 国自然面上D口祈祷 +4 monkeynana 2026-07-14 4/200 2026-07-15 09:14 by 白水煮
[论文投稿] 跨出版社商投稿 20+4 倪好520 2026-07-13 4/200 2026-07-15 08:35 by bobvan
[基金申请] 没收到消息，再次陪跑 +3 天空星辰fly 2026-07-14 3/150 2026-07-14 19:14 by 6543yes
[基金申请] 不要再数国自然申请书的 filecode 的分隔符个数了 +13 sadpencil 2026-07-12 20/1000 2026-07-14 13:12 by 杠就是你对
[基金申请] 明天E口面上会评 +8 布布和一二 2026-07-12 9/450 2026-07-13 22:59 by QTSorange
[基金申请] 祈祷青基必中 50+6 hadengry 2026-07-09 16/800 2026-07-12 20:31 by 登山虫虫
[考博] 27届辽宁大学应届毕业生申博 +3 可乐微风大海 2026-07-09 3/150 2026-07-10 21:23 by 贪玩的研究僧
[基金申请] 关于如何从代码看上不上会 +17 且听虎啸 2026-07-09 23/1150 2026-07-10 19:51 by sdfapple719
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭