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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR模板RNA逆转录为CDNA后，CT值过大
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daisyhappy

铜虫 (小有名气)

[求助] QPCR模板RNA逆转录为CDNA后，CT值过大

请教大家一个问题，由于试剂盒中的标准品是RNA，但是这个不好保存太不稳定易降解，所以我现在讲其全部一次性逆转录成CDNA，想用这个作为标准品进行定量。但是将CDNA进行梯度稀释以后，发现CT值偏大，一般在28以后，最大的到38，根本无法准确定量。电泳检测还是有产物的。想请问大家：
1.有没有好的方法解决这种标准品是RNA的问题？或者溶在乙醇里面保存？
2.我开始做的几次QPCR复孔重复性挺好的，但是现在做总是重复性不好。不知道哪里出了问题？我用的试剂等分别是一个厂家的，但是不同的试剂盒。
请大家帮忙分析，谢谢！
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1楼 2012-12-10 10:51:06
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love_st

金虫 (著名写手)
试剂盒里面的标准品是否浓度较高，如果本身就不高，那么你反转录过来后肯定浓度也不高，还有你反转录效果如何
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2楼2012-12-10 14:57:13
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daisyhappy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by love_st at 2012-12-10 14:57:13
试剂盒里面的标准品是否浓度较高，如果本身就不高，那么你反转录过来后肯定浓度也不高，还有你反转录效果如何

标准品的浓度是不太高的。反转效果还可以的啊。
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3楼2012-12-10 17:27:39
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by daisyhappy at 2012-12-10 17:27:39
标准品的浓度是不太高的。反转效果还可以的啊。...

那么你问下厂家标准品浓度Ct值大概在哪儿不就明白了么
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4楼2012-12-11 14:12:23
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daisyhappy

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by love_st at 2012-12-11 14:12:23
那么你问下厂家标准品浓度Ct值大概在哪儿不就明白了么...

这个我是知道的啊。我开始做的几次和后来做的几次的CT值有一些差别，所以我觉得是降解了。现在的问题是怎么更好的保存和解决RNA作为标准品不稳定容易降解的问题。还有怎么保证良好的重复性。有没有好的建议和方法没？
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5楼2012-12-12 12:39:14
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love_st

金虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by daisyhappy at 2012-12-12 12:39:14
这个我是知道的啊。我开始做的几次和后来做的几次的CT值有一些差别，所以我觉得是降解了。现在的问题是怎么更好的保存和解决RNA作为标准品不稳定容易降解的问题。还有怎么保证良好的重复性。有没有好的建议和方法没 ...

试剂盒里一般都不建议你反复冻融，特别是标准品如果是RNA的话，反复冻融肯定浓度多少会降低，良好的重复性是建立在你的良好的操作习惯，操作手法上面的。没有好的建议。
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6楼2012-12-12 16:57:57
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feixiang1209

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

CT超过30一般都不是好结果了，很有可能是引物二聚体了。你做no cmplete control了吗？对比一下，我觉得扩增的很可能是引物二聚体。至于原因，可能是RNA降解了或者反转录后浓度太低了。
RNA那么容易降解怎么会把RNA做成标准品呢，运输过程怎么保证呢？就算保证了也就放一个月左右。想不通
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7楼2013-05-07 21:12:18
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沙门小rna

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

rna逆转录前。1.看下电泳确定rna的质量。2.如果确定是rna标准品。冰上操作和尽量减少操作时间是关键。3.模板的量不能太多。cdna模板的浓度控制在2ng左右比较好。4pcr体系，这个条件都要摸得。~
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应助之星就是我~没错。你没有看错~
8楼2013-11-04 13:19:43
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