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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 我的RT-CR有什么问题
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fistwl

新虫 (小有名气)

[求助] 我的RT-CR有什么问题 已有2人参与

上普通的PCR验证过引物，一个是GAP，一个是ALP， 片段都是200bp， 都没有问题，可以P出来。但是一上RT-PCR就不行了，实验组的GAP和ALP的Ct值是5左右，直接在第四个循环的时候，就已经飙上去了，对照组的GAP也不行，Ct值也很低，就只有对照组的ALP的Ct值相对正常一些，在23左右，求问是什么原因，我已经做了六遍了，排除了加样问题，孔污染问题，引物质量问题等等。
PS， 我的cDNA是用6ug的RNA反转录的，不知道是不是因为这个问题，反转录酶是TAKARA的，RT-PCR的SYBR是Bio-rad的
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1楼 2014-05-08 14:33:14
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

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fistwl(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-08 19:16:26
“实验组的GAP和ALP的Ct值是5左右，直接在第四个循环的时候，就已经飙上去”
“我的cDNA是用6ug的RNA反转录的”
明显是你的RNA(cDNA)模板量太大了，我们都是用1ug RNA做逆转录然后做的，如果是6ug，把你cDNA稀释1000倍后再做
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2楼2014-05-08 14:46:26
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junnavme2014

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-05-08 21:52:32
把模板稀释5-10倍以后再用，如果还早了再稀释，一般控制在18-25课循环出峰为好
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3楼2014-05-08 19:53:14
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fistwl

新虫 (小有名气)
我昨天晚上做了一个稀释十倍和稀释50倍的，结果更诡异，直接4个循环荧光值又飙到10去了，我的心已经死了，打算等隔壁实验室的师兄回来给我做一次
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4楼2014-05-09 09:04:24
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