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fistwl

新虫 (小有名气)

[求助] 我的RT-CR有什么问题 已有2人参与

上普通的PCR验证过引物,一个是GAP,一个是ALP, 片段都是200bp, 都没有问题,可以P出来。但是一上RT-PCR就不行了,实验组的GAP和ALP的Ct值是5左右,直接在第四个循环的时候,就已经飙上去了,对照组的GAP也不行,Ct值也很低,就只有对照组的ALP的Ct值相对正常一些,在23左右,求问是什么原因,我已经做了六遍了,排除了加样问题,孔污染问题,引物质量问题等等。
PS, 我的cDNA是用6ug的RNA反转录的,不知道是不是因为这个问题,反转录酶是TAKARA的,RT-PCR的SYBR是Bio-rad的
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gyesang

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【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
fistwl(西门吹雪170代发): 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-08 19:16:26
“实验组的GAP和ALP的Ct值是5左右,直接在第四个循环的时候,就已经飙上去”
“我的cDNA是用6ug的RNA反转录的”
明显是你的RNA(cDNA)模板量太大了,我们都是用1ug RNA做逆转录然后做的,如果是6ug,把你cDNA稀释1000倍后再做
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2014-05-08 14:46:26
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junnavme2014

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-05-08 21:52:32
把模板稀释5-10倍以后再用,如果还早了再稀释,一般控制在18-25课循环出峰为好
3楼2014-05-08 19:53:14
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fistwl

新虫 (小有名气)

我昨天晚上做了一个稀释十倍和稀释50倍的,结果更诡异,直接4个循环荧光值又飙到10去了,我的心已经死了,打算等隔壁实验室的师兄回来给我做一次
4楼2014-05-09 09:04:24
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