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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » RT-PCR的标准曲线的构建相关
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lhf903

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR的标准曲线的构建相关

我现在提取了土壤总DNA，以DNA为模板，用特定引物进行RT-PCR。
        以PCR产物为模板TA克隆后，挑一个平板上的克隆子扩大培养后提取质粒构建标准曲线。现在的问题是引物是简并引物，PCR产物就是不同序列的混合，平板上的克隆子不是同样的东西，提取质粒的话，需要多挑几个，分别测序后把扩大培养的菌液混合后提取质粒吗？
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1楼2013-08-20 22:36:28
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lhf903: 金币+20, ★有帮助 2013-08-23 08:52:42
不明白LZ的意思，既然是DNA为模板怎么回事RT-PCR呢？再者，为什么分别测序后又混合提取质粒？
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互助互励，共奋共进！！
2楼2013-08-21 01:36:41
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yjswangjian

金虫 (著名写手)
不懂，顶一下
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3楼2013-08-21 06:37:13
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lhf903

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-21 01:36:41
不明白LZ的意思，既然是DNA为模板怎么回事RT-PCR呢？再者，为什么分别测序后又混合提取质粒？

我是以土壤总DNA为模板，用特定引物扩增一段序列，这段序列未完全清楚，所以用的简并引物，引物的某些位置代表一个以上的碱基。
    我用的是标准曲线绝对定量法，提取质粒后测定浓度，测序得到序列长度，换算出拷贝数，再梯度稀释作出标曲。我的意思是样品经过简并引物扩增后，每种可能序列都得到了扩增，而标准品如果只是提取其中一种可能序列的质粒，会不会有偏差~
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4楼2013-08-21 08:52:13
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