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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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lhf903

金虫 (正式写手)

[求助] RT-PCR的标准曲线的构建相关

我现在提取了土壤总DNA,以DNA为模板,用特定引物进行RT-PCR。
        以PCR产物为模板TA克隆后,挑一个平板上的克隆子扩大培养后提取质粒构建标准曲线。现在的问题是引物是简并引物,PCR产物就是不同序列的混合,平板上的克隆子不是同样的东西,提取质粒的话,需要多挑几个,分别测序后把扩大培养的菌液混合后提取质粒吗?
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lhf903

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Sthunder at 2013-08-21 01:36:41
不明白LZ的意思,既然是DNA为模板怎么回事RT-PCR呢?再者,为什么分别测序后又混合提取质粒?

我是以土壤总DNA为模板,用特定引物扩增一段序列,这段序列未完全清楚,所以用的简并引物,引物的某些位置代表一个以上的碱基。
    我用的是标准曲线绝对定量法,提取质粒后测定浓度,测序得到序列长度,换算出拷贝数,再梯度稀释作出标曲。我的意思是样品经过简并引物扩增后,每种可能序列都得到了扩增,而标准品如果只是提取其中一种可能序列的质粒,会不会有偏差~
4楼2013-08-21 08:52:13
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Sthunder

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
lhf903: 金币+20, 有帮助 2013-08-23 08:52:42
不明白LZ的意思,既然是DNA为模板怎么回事RT-PCR呢?再者,为什么分别测序后又混合提取质粒?
互助互励,共奋共进!!
2楼2013-08-21 01:36:41
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