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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 新手求助PCR产物Blast问题，先谢谢大家了
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18988582

银虫 (正式写手)

[求助] 新手求助PCR产物Blast问题，先谢谢大家了

目的基因是HSP90
我在NCBI设计了一对引物，产物长度大概为300bp，但是跑出来的结果，电泳显示为500bp，拿去测序发现结果为500bp，在ncbi上进行比对，结果显示为下图，中间有一个GAP，求问为什么呢？

还有一个问题是正向测序和反向测序结果有什么区别，我两个方向都测了，结果不太一样啊！

反向测序结果.jpg



正向测序.jpg
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1楼2013-01-12 16:01:51
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夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引物不好吧，扩出非特异性条带了。
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2楼2013-01-12 16:22:13
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18988582

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 夏尔list at 2013-01-12 16:22:13
引物不好吧，扩出非特异性条带了。

谢谢回复，产物测序后有部分序列比对是正确的啊。我做的这个生物的HSP90在ncbi上没有数据。

你看主要还是引物问题吗？
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3楼2013-01-12 16:24:28
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夏尔list

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

300bp的话，不知道是连载体测，还是直接PCR产物测的。一般测序引物那段几十bp测不出来的。
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4楼2013-01-12 16:27:09
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18988582

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏尔list at 2013-01-12 16:27:09
300bp的话，不知道是连载体测，还是直接PCR产物测的。一般测序引物那段几十bp测不出来的。

我是PCR产物直接测序的，还有那个GAP是怎么回事呢？
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5楼2013-01-12 16:31:03
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18988582

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 夏尔list at 2013-01-12 16:27:09
300bp的话，不知道是连载体测，还是直接PCR产物测的。一般测序引物那段几十bp测不出来的。

补充一下，我的条带很亮，而且是单一的。
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6楼2013-01-12 16:40:48
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-12 22:10:29
正反向测序的2个结果是反向互补的，但不能确定到底哪一个是反向互补哪一个是标准的。你这个结果，两个引物之间是300bp,出现了500bp条带，应该是非特异性扩增了。你要blast后面的文字结果比较下，是不是其他物种，基因名称和你一样的？
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7楼2013-01-12 17:02:50
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18988582

银虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2013-01-12 17:02:50
正反向测序的2个结果是反向互补的，但不能确定到底哪一个是反向互补哪一个是标准的。你这个结果，两个引物之间是300bp,出现了500bp条带，应该是非特异性扩增了。你要blast后面的文字结果比较下，是不是其他物种，基 ...

你好，感谢回复。Blast后面的文字结果，基因和我是一样的，是其他物种的，和我的物种亲缘关系比较接近
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8楼2013-01-12 19:14:57
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wangpeng227

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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18988582: 金币+10, ★★★很有帮助 2013-02-01 10:31:06
1. 不同物种可能是不同的
2. 是不是你的这个基因有不同的RNA剪接方式？
3. 是不是你扩增到的片段是保留内含子的那种？也可能是DNA的污染？
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9楼2013-01-12 22:41:06
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18988582

银虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by wangpeng227 at 2013-01-12 22:41:06
1. 不同物种可能是不同的
2. 是不是你的这个基因有不同的RNA剪接方式？
3. 是不是你扩增到的片段是保留内含子的那种？也可能是DNA的污染？

你好，我设计的引物是300，跑出来有500

针对你这几个原因，有没有验证方法或者解决方法！

谢谢！
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10楼2013-01-13 15:01:33
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