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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR程序设计的问题
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

[求助] PCR程序设计的问题

目标片段900多bp，引物1Tm值66.72，引物2Tm值65.52，请问用什么样的PCR程序好？
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1楼 2011-05-13 11:09:27
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-05-13 13:40:25
1：首先做一个温度梯度（退火温度）看看哪一个温度下P出来的条带最亮，TM1+TM2/2=66.12,可以设置如下梯度：60 62 64 66 68 ；

2：延伸1:30,25个循环就可以，因为你只是看一下哪一个温度下最亮，所以循环数25个循环足矣。

貌似我都给你做了。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-05-13 12:21:32
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gagalady

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 可行 2011-05-13 15:40:51
cycle1:94° 3min
cycle2：94° 30sec  60° 30sec 72° 70sec   30个循环
cycle3：72° 10min
cycle4: 4° ∞
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3楼2011-05-13 12:37:52
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-13 12:21:32:
1：首先做一个温度梯度（退火温度）看看哪一个温度下P出来的条带最亮，TM1+TM2/2=66.12,可以设置如下梯度：60 62 64 66 68 ；

2：延伸1:30,25个循环就可以，因为你只是看一下哪一个温度下最亮，所以循环数25个 ...

昨天我63度作了一次，结果只有marker的条带
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4楼2011-05-13 12:53:22
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bbwalkman

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-05-13 15:41:32
63℃再低点，温度做个梯度~~~循环数25~35之间吧 别太多了~~~再看看你的酶 是不是热启动的~~然后考虑设定程序~~
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5楼2011-05-13 15:10:18
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by catmihzh at 2011-05-13 12:53:22:
昨天我63度作了一次，结果只有marker的条带

所以嘛，你要设置一个温度梯度咯。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-05-13 15:26:49
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 赞成！ 2011-05-13 17:41:44
tm设置成很低的 先p出来 在往上调
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海纳百川止于至善
7楼2011-05-13 15:42:05
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-13 15:26:49:
所以嘛，你要设置一个温度梯度咯。

上次我设了55-66度，结果也没有
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8楼2011-05-13 15:56:23
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

catmihzh(金币+5): 谢谢 2011-05-13 19:05:41
引用回帖:
Originally posted by catmihzh at 2011-05-13 15:56:23:
上次我设了55-66度，结果也没有

你两条引物TM值都挺高的，按照我给你说的设置梯度P一下看看，应该没有什么问题的。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
9楼2011-05-13 16:22:26
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gagalady

新虫 (正式写手)
1949stone: 谢谢哦 2011-05-13 19:43:26
引用回帖:
Originally posted by gagalady at 2011-05-13 12:37:52:
cycle1:94° 3min
cycle2：94° 30sec  60° 30sec 72° 70sec   30个循环
cycle3：72° 10min
cycle4: 4° ∞


呵呵 送给1949stone一朵小红花
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10楼2011-05-13 16:32:45
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