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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR程序设计的问题
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-13 16:22:26:
你两条引物TM值都挺高的，按照我给你说的设置梯度P一下看看，应该没有什么问题的。。

按你说的P了，又只有marker。。。
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11楼2011-05-15 19:38:46
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by catmihzh at 2011-05-15 19:38:46:
按你说的P了，又只有marker。。。

你的引物没有什么问题吧？
你给我具体说说你是怎么操作的？
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12楼2011-05-15 19:52:52
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-15 19:52:52:
你的引物没有什么问题吧？
你给我具体说说你是怎么操作的？

引物应该没什么问题，具体操作就是常规地加完体系去PCR啊，我的体系是：
10×PCR Buffer 2μl
dNTP Mixture 0.5
引物1 0.5
引物2 0.5
基因组DNA模板 3.0
Taq plus Polymerase 0.5
ddH2O 18
你看看有没有什么问题？
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13楼2011-05-15 21:05:39
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-05-16 09:01:05
引用回帖:
Originally posted by catmihzh at 2011-05-15 21:05:39:
引物应该没什么问题，具体操作就是常规地加完体系去PCR啊，我的体系是：
10×PCR Buffer 2μl
dNTP Mixture 0.5
引物1 0.5
引物2 0.5
基因组DNA模板 3.0
Taq plus Polymerase 0.5
ddH2O 18
你看看有没 ...

你这样做试试

50ul体系：
10×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture   1ul
引物1 1ul
引物2 1ul
基因组DNA模板 1ul（可以用genome和裂解的菌体）
Taq plus Polymerase 1ul
ddH2O 补至50ul

分装5管，5个不同温度梯度试试。

你buffer加的太少，10倍的buffer啊。。。
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14楼2011-05-15 22:11:11
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-15 22:11:11:
你这样做试试

50ul体系：
10×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture   1ul
引物1 1ul
引物2 1ul
基因组DNA模板 1ul（可以用genome和裂解的菌体）
Taq plus Polymerase 1ul
ddH2O 补至50ul

分装5管，5个 ...

我还真没注意到buffer的问题。。。谢谢啊，我再试试
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15楼2011-05-15 23:29:05
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-15 22:11:11:
你这样做试试

50ul体系：
10×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture   1ul
引物1 1ul
引物2 1ul
基因组DNA模板 1ul（可以用genome和裂解的菌体）
Taq plus Polymerase 1ul
ddH2O 补至50ul

分装5管，5个 ...

这周末才又做了实验，我改了PCR Buffer和dNTP的量（因为我买的是25mM的），然后还换了一个片段来P（我总共要P三个片段）
25ul体系：
10×PCR Buffer 2.5μl
dNTP Mixture（25mM稀释10倍） 2ul
引物1 0.5ul
引物2 0.5ul
基因组DNA模板 3ul（可以用genome和裂解的菌体）
Taq plus Polymerase 0.5ul
ddH2O 补至25ul

P了五管，都有条带
真是非常感谢你的帮助
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16楼2011-05-22 14:18:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5): 热心啊~顺便恭喜楼主！ 2011-05-22 18:36:33
引用回帖:
Originally posted by catmihzh at 2011-05-22 14:18:08:
这周末才又做了实验，我改了PCR Buffer和dNTP的量（因为我买的是25mM的），然后还换了一个片段来P（我总共要P三个片段）
25ul体系：
10×PCR Buffer 2.5μl
dNTP Mixture（25mM稀释10倍） 2ul
引物1 0.5ul ...

恭喜。。。不过模板0.5ul就可以了。。。
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17楼2011-05-22 15:32:33
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-22 15:32:33:
恭喜。。。不过模板0.5ul就可以了。。。

呃，因为对这个量比较没把握，其实也挺心疼的，毕竟提一次基因组挺烦的，以后再减少一下用量
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18楼2011-05-22 18:32:50
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
Originally posted by catmihzh at 2011-05-22 18:32:50:
呃，因为对这个量比较没把握，其实也挺心疼的，毕竟提一次基因组挺烦的，以后再减少一下用量

用试剂盒提基因组，小事情嘛。。。半个小时就搞定了。。。
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19楼2011-05-22 19:27:40
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-22 19:27:40:
用试剂盒提基因组，小事情嘛。。。半个小时就搞定了。。。

我们实验室穷啊。。。一般能省则省，除非一些自己搞不定的才买试剂盒，而且我们提的是真菌的基因组
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20楼2011-05-23 13:27:12
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