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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR程序设计的问题
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长

[求助] PCR程序设计的问题

目标片段900多bp，引物1Tm值66.72，引物2Tm值65.52，请问用什么样的PCR程序好？
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
1楼 2011-05-13 11:09:27
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-15 22:11:11:
你这样做试试

50ul体系：
10×PCR Buffer 5μl
dNTP Mixture   1ul
引物1 1ul
引物2 1ul
基因组DNA模板 1ul（可以用genome和裂解的菌体）
Taq plus Polymerase 1ul
ddH2O 补至50ul

分装5管，5个 ...

这周末才又做了实验，我改了PCR Buffer和dNTP的量（因为我买的是25mM的），然后还换了一个片段来P（我总共要P三个片段）
25ul体系：
10×PCR Buffer 2.5μl
dNTP Mixture（25mM稀释10倍） 2ul
引物1 0.5ul
引物2 0.5ul
基因组DNA模板 3ul（可以用genome和裂解的菌体）
Taq plus Polymerase 0.5ul
ddH2O 补至25ul

P了五管，都有条带
真是非常感谢你的帮助
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
16楼2011-05-22 14:18:08
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-05-13 13:40:25
1：首先做一个温度梯度（退火温度）看看哪一个温度下P出来的条带最亮，TM1+TM2/2=66.12,可以设置如下梯度：60 62 64 66 68 ；

2：延伸1:30,25个循环就可以，因为你只是看一下哪一个温度下最亮，所以循环数25个循环足矣。

貌似我都给你做了。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-05-13 12:21:32
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gagalady

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

1949stone(EPI+1): 可行 2011-05-13 15:40:51
cycle1:94° 3min
cycle2：94° 30sec  60° 30sec 72° 70sec   30个循环
cycle3：72° 10min
cycle4: 4° ∞
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2011-05-13 12:37:52
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-05-13 12:21:32:
1：首先做一个温度梯度（退火温度）看看哪一个温度下P出来的条带最亮，TM1+TM2/2=66.12,可以设置如下梯度：60 62 64 66 68 ；

2：延伸1:30,25个循环就可以，因为你只是看一下哪一个温度下最亮，所以循环数25个 ...

昨天我63度作了一次，结果只有marker的条带
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
4楼2011-05-13 12:53:22
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