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新虫 (初入文坛)

[求助] 普通PCR和qPCR遇到问题,求助已有2人参与

各位大神,我最近在做植物基因,遇到费解的问题了,求助呀!
  提出的RNA跑胶验证 条带良好,随之进行RT-PCR。用得到的cDNA产物先做了一下Actin的普通PCR,结果屡次不出结果。RNA和cDNA的浓度都挺高的,请问这是什么情况?哪里出问题了? 我也尝试了用这些cDNA模板去做qPCR,结果Actin的出峰也不理想,总是有严重的杂峰。按说Actin不应该出现这种情况啊!
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2015-01-04 13:19:49
两个原因:
1、cDNA反转录有问题,如果反转录没有成功就扩增不出产物;
2、Actin引物问题,建议排查此内参引物是否适用该物种。
没有做不到,只有想不到!
2楼2015-01-04 10:23:46
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1291115202

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-01-04 10:23:46
两个原因:
1、cDNA反转录有问题,如果反转录没有成功就扩增不出产物;
2、Actin引物问题,建议排查此内参引物是否适用该物种。

我做普通PCR和qPCR所用的两种Actin引物是实验室的师兄师姐之前合成的,并且都做出结果了,我们 做的是同一种植物。感觉应该不是引物的问题吧~~反转录不成功会有哪些方面什么原因呢?
3楼2015-01-05 14:42:32
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阿尔卑斯英

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
反转录试剂的添加,反转录引物的选择及反应程序的设置,
4楼2015-01-06 10:17:42
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1291115202

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 阿尔卑斯英 at 2015-01-06 10:17:42
反转录试剂的添加,反转录引物的选择及反应程序的设置,

好吧~有可能是酶失活了吧,待验证中...
5楼2015-01-06 14:32:30
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