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lfieng_1990

新虫 (初入文坛)


[求助] QPCR溶解曲线问题 已有2人参与

各位好:
       最近做对一个基因做验证QPCR实验,扩增曲线显示几乎没有扩增,溶解曲线如下,前面一部分比较高,溶解峰看起来也还好,不知道是什么原因?

QPCR溶解曲线问题


QPCR溶解曲线问题-1
Melt Curve.jpg
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令狐少陈

铜虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-28 18:02:40
是SYBR相对定量吗?
先说说扩增曲线,只能说明你的起始模版不够,或者引物扩增效率太低(可能退火稳定引起也可能本身引物不好),说明你没有做普通PCR摸条件验证,一般30个循环跑电泳看不到清晰的条带肯定不行。
其次看你的溶解曲线,后面Tm85 说明你的条带应该扩出来了,并且重在一起,应该是你的目的片段。但前面那么高的峰,可能是你的引物一开始就是二聚体,后面才慢慢分开扩增片段。你跑个胶看看有没有引物!
多多交流,海纳百川
2楼2014-08-28 13:50:36
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2014-08-28 22:56:27
前面比较高的荧光值是反应体系中的背景荧光值,主要是SYBR Green I和你的模板结合发出的荧光信号,由于目标产物浓度太低,所以背景值显得高些。扩增比较好情况下,目标产物的溶解曲线的荧光值远远高于背景荧光值,就不会有这种现象了。
rainwater
3楼2014-08-28 15:49:17
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lfieng_1990

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by 令狐少陈 at 2014-08-28 13:50:36
是SYBR相对定量吗?
先说说扩增曲线,只能说明你的起始模版不够,或者引物扩增效率太低(可能退火稳定引起也可能本身引物不好),说明你没有做普通PCR摸条件验证,一般30个循环跑电泳看不到清晰的条带肯定不行。
...

多谢了,好专业的回答~
4楼2014-08-28 16:54:11
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lfieng_1990

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-08-28 15:49:17
前面比较高的荧光值是反应体系中的背景荧光值,主要是SYBR Green I和你的模板结合发出的荧光信号,由于目标产物浓度太低,所以背景值显得高些。扩增比较好情况下,目标产物的溶解曲线的荧光值远远高于背景荧光值,就 ...

哦,了解了,多谢
5楼2014-08-28 16:55:35
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lishaojun3

新虫 (初入文坛)

前辈,我现在也遇到这个问题。后面是如何处理的?是什么原因啊?
6楼2015-04-17 21:27:38
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