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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » QPCR溶解曲线问题
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lfieng_1990

新虫 (初入文坛)

[求助] QPCR溶解曲线问题 已有2人参与

各位好：
       最近做对一个基因做验证QPCR实验，扩增曲线显示几乎没有扩增，溶解曲线如下，前面一部分比较高，溶解峰看起来也还好，不知道是什么原因？

QPCR溶解曲线问题


QPCR溶解曲线问题-1
Melt Curve.jpg
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1楼 2014-08-28 12:31:11
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zhangyunjing

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-08-28 22:56:27
前面比较高的荧光值是反应体系中的背景荧光值，主要是SYBR Green I和你的模板结合发出的荧光信号，由于目标产物浓度太低，所以背景值显得高些。扩增比较好情况下，目标产物的溶解曲线的荧光值远远高于背景荧光值，就不会有这种现象了。
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rainwater
3楼2014-08-28 15:49:17
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令狐少陈

铜虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2014-08-28 18:02:40
是SYBR相对定量吗？
先说说扩增曲线，只能说明你的起始模版不够，或者引物扩增效率太低（可能退火稳定引起也可能本身引物不好），说明你没有做普通PCR摸条件验证，一般30个循环跑电泳看不到清晰的条带肯定不行。
其次看你的溶解曲线，后面Tm85 说明你的条带应该扩出来了，并且重在一起，应该是你的目的片段。但前面那么高的峰，可能是你的引物一开始就是二聚体，后面才慢慢分开扩增片段。你跑个胶看看有没有引物！
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多多交流，海纳百川
2楼2014-08-28 13:50:36
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lfieng_1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 令狐少陈 at 2014-08-28 13:50:36
是SYBR相对定量吗？
先说说扩增曲线，只能说明你的起始模版不够，或者引物扩增效率太低（可能退火稳定引起也可能本身引物不好），说明你没有做普通PCR摸条件验证，一般30个循环跑电泳看不到清晰的条带肯定不行。
...

多谢了，好专业的回答~
赞一下 回复此楼
4楼2014-08-28 16:54:11
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lfieng_1990

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhangyunjing at 2014-08-28 15:49:17
前面比较高的荧光值是反应体系中的背景荧光值，主要是SYBR Green I和你的模板结合发出的荧光信号，由于目标产物浓度太低，所以背景值显得高些。扩增比较好情况下，目标产物的溶解曲线的荧光值远远高于背景荧光值，就 ...

哦，了解了，多谢
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5楼2014-08-28 16:55:35
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