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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求助检测基因沉默的qPCR引物设计问题
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greenygreen

银虫 (小有名气)

[求助] 求助检测基因沉默的qPCR引物设计问题 已有2人参与

看了专门介绍的protocol，要求上下游的引物要跨越siRNA的target位点。但是有的文献上也不是这么设计的，就是还是mRNA的保守位置。因为siRNA切割mRNA之后，随着时间的延长和循环整条mRNA都会降解。所以有点糊涂了，求亲自做过的大神解答。我是细胞转染siRNA之后继续培养24小时，收细胞提总RNA的。
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1楼 2014-05-07 19:23:03
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
greenygreen: 金币+2 2014-05-07 20:58:35
可以试试IOS技术直接把沉默的基因敲除
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2楼2014-05-07 19:58:07
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
greenygreen: 金币+10 2014-05-08 09:23:11
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-08 19:19:58
如果是细胞转染siRNA之后，然后检测靶基因的表达，realtime引物可以设计在靶基因的任何位置，因为siRNA会引起靶mRNA的降解而不是翻译的抑制，这一点跟microRNA不同
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2014-05-08 01:11:20
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greenygreen

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-08 01:11:20
如果是细胞转染siRNA之后，然后检测靶基因的表达，realtime引物可以设计在靶基因的任何位置，因为siRNA会引起靶mRNA的降解而不是翻译的抑制，这一点跟microRNA不同

那我就放心了，也就是说，在我的检测时间（转染后24小时），siRNA肯定吧mRNA咔咔都切了是吧，而不仅仅是靶位点的一切为二。
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4楼2014-05-08 09:24:09
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
greenygreen: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-05-08 21:12:26
引用回帖:
4楼: Originally posted by greenygreen at 2014-05-08 09:24:09
那我就放心了，也就是说，在我的检测时间（转染后24小时），siRNA肯定吧mRNA咔咔都切了是吧，而不仅仅是靶位点的一切为二。...

不是靶位点的一切二，siRNA转染24小时后，不是检测干扰的最佳时间，一般36-48h比较合适
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2014-05-08 14:28:51
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greenygreen

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-08 14:28:51
不是靶位点的一切二，siRNA转染24小时后，不是检测干扰的最佳时间，一般36-48h比较合适...

我现在qPCR和western都做，24小时之后检测mRNA，48小时检测蛋白滴。
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6楼2014-05-08 21:14:01
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gyesang

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引用回帖:
6楼: Originally posted by greenygreen at 2014-05-08 21:14:01
我现在qPCR和western都做，24小时之后检测mRNA，48小时检测蛋白滴。...

那也是可以的，可能的话，都在48小时检测比较好
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2014-05-08 21:33:02
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greenygreen

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-08 21:33:02
那也是可以的，可能的话，都在48小时检测比较好...

OK
试一试~
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8楼2014-05-09 09:06:36
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