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greenygreen

银虫 (小有名气)

[求助] 求助检测基因沉默的qPCR引物设计问题 已有2人参与

看了专门介绍的protocol,要求上下游的引物要跨越siRNA的target位点。但是有的文献上也不是这么设计的,就是还是mRNA的保守位置。因为siRNA切割mRNA之后,随着时间的延长和循环整条mRNA都会降解。所以有点糊涂了,求亲自做过的大神解答。我是细胞转染siRNA之后继续培养24小时,收细胞提总RNA的。
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小刀188

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
greenygreen: 金币+2 2014-05-07 20:58:35
可以试试IOS技术直接把沉默的基因敲除
2楼2014-05-07 19:58:07
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
greenygreen: 金币+10 2014-05-08 09:23:11
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2014-05-08 19:19:58
如果是细胞转染siRNA之后,然后检测靶基因的表达,realtime引物可以设计在靶基因的任何位置,因为siRNA会引起靶mRNA的降解而不是翻译的抑制,这一点跟microRNA不同
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
3楼2014-05-08 01:11:20
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greenygreen

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-08 01:11:20
如果是细胞转染siRNA之后,然后检测靶基因的表达,realtime引物可以设计在靶基因的任何位置,因为siRNA会引起靶mRNA的降解而不是翻译的抑制,这一点跟microRNA不同

那我就放心了,也就是说,在我的检测时间(转染后24小时),siRNA肯定吧mRNA咔咔都切了是吧,而不仅仅是靶位点的一切为二。
4楼2014-05-08 09:24:09
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gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
greenygreen: 金币+4, ★★★很有帮助 2014-05-08 21:12:26
引用回帖:
4楼: Originally posted by greenygreen at 2014-05-08 09:24:09
那我就放心了,也就是说,在我的检测时间(转染后24小时),siRNA肯定吧mRNA咔咔都切了是吧,而不仅仅是靶位点的一切为二。...

不是靶位点的一切二,siRNA转染24小时后,不是检测干扰的最佳时间,一般36-48h比较合适
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2014-05-08 14:28:51
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greenygreen

银虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-08 14:28:51
不是靶位点的一切二,siRNA转染24小时后,不是检测干扰的最佳时间,一般36-48h比较合适...

我现在qPCR和western都做,24小时之后检测mRNA,48小时检测蛋白滴。
6楼2014-05-08 21:14:01
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gyesang

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引用回帖:
6楼: Originally posted by greenygreen at 2014-05-08 21:14:01
我现在qPCR和western都做,24小时之后检测mRNA,48小时检测蛋白滴。...

那也是可以的,可能的话,都在48小时检测比较好
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
7楼2014-05-08 21:33:02
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greenygreen

银虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by gyesang at 2014-05-08 21:33:02
那也是可以的,可能的话,都在48小时检测比较好...

OK
试一试~
8楼2014-05-09 09:06:36
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