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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 普通PCR和qPCR遇到问题，求助
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1291115202

新虫 (初入文坛)

[求助] 普通PCR和qPCR遇到问题，求助 已有2人参与

各位大神，我最近在做植物基因，遇到费解的问题了，求助呀！
  提出的RNA跑胶验证 条带良好，随之进行RT-PCR。用得到的cDNA产物先做了一下Actin的普通PCR，结果屡次不出结果。RNA和cDNA的浓度都挺高的，请问这是什么情况？哪里出问题了？ 我也尝试了用这些cDNA模板去做qPCR，结果Actin的出峰也不理想，总是有严重的杂峰。按说Actin不应该出现这种情况啊！
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1楼 2015-01-04 09:16:19
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2015-01-04 13:19:49
两个原因：
1、cDNA反转录有问题，如果反转录没有成功就扩增不出产物；
2、Actin引物问题，建议排查此内参引物是否适用该物种。
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没有做不到，只有想不到！
2楼2015-01-04 10:23:46
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1291115202

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 王平阳 at 2015-01-04 10:23:46
两个原因：
1、cDNA反转录有问题，如果反转录没有成功就扩增不出产物；
2、Actin引物问题，建议排查此内参引物是否适用该物种。

我做普通PCR和qPCR所用的两种Actin引物是实验室的师兄师姐之前合成的，并且都做出结果了，我们 做的是同一种植物。感觉应该不是引物的问题吧~~反转录不成功会有哪些方面什么原因呢？
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3楼2015-01-05 14:42:32
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阿尔卑斯英

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
反转录试剂的添加，反转录引物的选择及反应程序的设置，
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4楼2015-01-06 10:17:42
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1291115202

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 阿尔卑斯英 at 2015-01-06 10:17:42
反转录试剂的添加，反转录引物的选择及反应程序的设置，

好吧~有可能是酶失活了吧，待验证中...
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5楼2015-01-06 14:32:30
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