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star1987

木虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】PCR问题求助

请教高手一个问题,我做PCR的时候用上海生工DNA Taq polymerase(红盖子的)(退火温度梯度从45度到65度)都能P出来,而且条带很亮,但是用LA Taq polymerase、Ex Taq polymerase和Prime Star都P不出来。这是什么原因?
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adslye

银虫 (正式写手)


★ ★ ★
silicare(金币+3):很热心的说~ 2010-12-22 11:53:29
star1987(金币+2):非常感谢! 2010-12-24 16:34:58
引用回帖:
Originally posted by star1987 at 2010-12-21 20:24:37:

模板是基因组。关键是高保真的酶P不出来。谢谢!

基因组最好要酶切~生工的酶的确效率很高,但有时候P出的那是啥啊!不敢恭维~~
我最近也是再做这个,恰好酶用的和你一样,生工,TAKARA LA, 还有一个2Xmix的。

因为,我是基因组酶切后P的,所以都能P出来,我这的问题是2K以上的片段只能LA来P。

总之我的建议是:
1,确定你的基因组的纯化做的OK,没有酚什么残留。
2, 如果你还用基因组P,那就稀释下做模板。
3,强烈建议酶切乙醇纯化后再P。5,6个识别碱基的酶都可以~
4,确定生工P出来的东西是对的,可能就是假阳性,那个效率太高的东西不一定可靠。
19楼2010-12-22 10:50:39
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sxxuan

金虫 (著名写手)



star1987(金币+1):谢谢 2010-12-21 16:21:28
rainwander(金币+1):鼓励积极参与~~~ 2010-12-21 19:07:20
不同的酶,条件有所不同吧。这种情况我也碰到过,当时是提高了退火温度
普通taq,好像比较容易P出来,高保真的没那么简单。当时师兄这样解释给我听
3楼2010-12-21 16:11:55
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star1987

木虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2010-12-21 16:11:55:
不同的酶,条件有所不同吧。这种情况我也碰到过,当时是提高了退火温度
普通taq,好像比较容易P出来,高保真的没那么简单。当时师兄这样解释给我听

不同的酶条件是不一样,但我用高保真的酶也做了温度梯度,还是P不出来。
4楼2010-12-21 16:21:09
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其实有时就是这样的情况,所以建议一直用一个公司的一种酶!
5楼2010-12-21 16:23:26
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