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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR求助，做不出来找不到原因
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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langduiyue

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
LZ  不知道的阴性 和  阳性 是个啥情况？
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角逐自我
11楼2010-10-26 16:15:12
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by langduiyue at 2010-10-26 16:15:12:
LZ  不知道的阴性 和  阳性 是个啥情况？

能具体说明吗？谢谢
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12楼2010-10-26 16:30:38
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langduiyue

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-27 07:09:20
LZ  你好。 不好意思，先前我看的不是很清楚。你的这个片段 没有人P过。所以没有做阳性。 如果阴性也没有的话，那应该不是什么污染的问题。  引物也是用primer5设计的，得分还比较高，那引应该也不应该有太大的问题。
我的建议：
（1）、DNA不知道你是怎么个提取过程，因为我是做小鼠的。不同的提取方法有很大的差异。 而且我们裂解 5 ，6个小时和 一夜，结果差异也很大，主要是组蛋白有没有彻底 裂解掉。
(2)、LZ， 可以针对保守序列（例：核糖小亚基） 再设计一对引物，对你的PCR做一下质控。
（3）、数我冒昧呀， 是不是序列调错了，还菌拿错了  实在是有点诡异呀

上面胡扯几句 希望能对LZ有点帮助
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角逐自我
13楼2010-10-26 16:57:18
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langduiyue

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
再扯两句  有时候 退火时间过长的话  非特异也会特别多， 理论上30 s 就可以搞定了， 建议做一下 退火时间的梯度。  延伸温度也是是要做一下 ， 可不能小瞧它的呀
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角逐自我
14楼2010-10-26 17:02:23
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-27 07:09:37
引用回帖:
Originally posted by ap at 2010-10-26 10:36:40:


谢谢！
1， 已知序列
2， 以TM值低5℃开始，2℃为梯度，做过退火温度梯度；用的是Takara 的pyrobest，20ul体系用1.6ul dntp； 延伸温度是72℃。做过模板浓度的摸索。对照是用大肠基因组和相应引物做的，PCR ...

假设是一个很保守的基因，那在大肠杆菌是不是也能扩增出来？


如果是已知序列。那就报道序列用的引物不更好么。
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15楼2010-10-26 19:37:38
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
silicare(金币+1):鼓励交流 2010-10-27 12:10:29
引用回帖:
Originally posted by ap at 2010-10-26 12:58:35:


因为我的目的基因的序列的原因，卡着我的目的基因设计引物，得分都很低。我想在目的基因上下游设计引物，得到“目的基因+上下游片段”后，再以它为模板PCR这样可行吗？

其实我原来有试过这样的，当然这是最后没办法时的办法，就是直接截取目的基因首尾前后做引物，用引物计算器算一下，如果能基本符合条件就可以试试，我曾经试出来过，那次做的虽然有杂带，但是我胶回收了一下就好了，因为实在是试了好多办法都出不来才用的这招。
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16楼2010-10-27 09:27:56
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by yixuanwin at 2010-10-26 19:37:38:


假设是一个很保守的基因，那在大肠杆菌是不是也能扩增出来？


如果是已知序列。那就报道序列用的引物不更好么。

报道序列用的引物指的是测序用的引物吗？
我的基因只测过序，没人做过实验。
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17楼2010-10-27 14:49:19
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