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ap

金虫 (正式写手)

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[交流] 【求助/交流】PCR求助，做不出来找不到原因已有4人参与

做了两个多周的PCR了，非常郁闷。是以霉菌基因组为模板做PCR的。共设计了四对引物，PCR三个基因。（其中有一对引物是PCR基因加上它上下游的）。发现都没有目的带。

1，模板质量应该没问题，跑过电泳，电泳大小在12K左右；OD600：OD800=1.81
2，引物设计，用Primer Premier设计的，有三组引物得分很高，与模板配对的引物长度为17~~20bp
3，PCR酶，DNTP，buffer没问题。用其他模板引物做过阳性对照，所以PCR得不到目的片段肯定是模板或引物的问题。

PCR产物杂带很多，曾经对大小差不多的条带回收酶切验证，仍然得不到目的基因。是不是还是引物的问题？我应该如何设计下一阶段的实验方案？

谢谢！

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1楼2010-10-26 09:22:02

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langduiyue

银虫 (小有名气)

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★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
reasonspare(金币+2):谢谢分享。 2010-10-27 07:09:20

LZ 你好。不好意思，先前我看的不是很清楚。你的这个片段没有人P过。所以没有做阳性。如果阴性也没有的话，那应该不是什么污染的问题。引物也是用primer5设计的，得分还比较高，那引应该也不应该有太大的问题。
我的建议：
（1）、DNA不知道你是怎么个提取过程，因为我是做小鼠的。不同的提取方法有很大的差异。而且我们裂解 5 ，6个小时和一夜，结果差异也很大，主要是组蛋白有没有彻底裂解掉。
(2)、LZ，可以针对保守序列（例：核糖小亚基）再设计一对引物，对你的PCR做一下质控。
（3）、数我冒昧呀，是不是序列调错了，还菌拿错了实在是有点诡异呀

上面胡扯几句希望能对LZ有点帮助