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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR求助，做不出来找不到原因
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ap

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR求助，做不出来找不到原因 已有4人参与

做了两个多周的PCR了，非常郁闷。是以霉菌基因组为模板做PCR的。共设计了四对引物，PCR三个基因。（其中有一对引物是PCR基因加上它上下游的）。发现都没有目的带。

1，模板质量应该没问题，跑过电泳，电泳大小在12K左右；OD600：OD800=1.81
2，引物设计，用Primer Premier设计的，有三组引物得分很高，与模板配对的引物长度为17~~20bp
3，PCR酶，DNTP，buffer没问题。用其他模板引物做过阳性对照，所以PCR得不到目的片段肯定是模板或引物的问题。

PCR产物杂带很多，曾经对大小差不多的条带回收酶切验证，仍然得不到目的基因。是不是还是引物的问题？我应该如何设计下一阶段的实验方案？

谢谢！
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1楼 2010-10-26 09:22:02
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langduiyue

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
再扯两句  有时候 退火时间过长的话  非特异也会特别多， 理论上30 s 就可以搞定了， 建议做一下 退火时间的梯度。  延伸温度也是是要做一下 ， 可不能小瞧它的呀
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角逐自我
14楼2010-10-26 17:02:23
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-26 10:55:09
前面很乱，也没理出头绪，但是杂带很多肯定是温度不对了，先升高温度看看，如果是弥散的那种那可能是模板浓度太大了
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2楼2010-10-26 09:51:53
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-26 10:55:24
1   用已知序列设计引物还是近缘序列设计引物

2   不同pcr退火温度  dntp用量 延伸温度都不一样。 你的对照如何做的。

3   既然有序列报道 尝试用报道序列提供的引物
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3楼2010-10-26 09:57:03
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ap

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 09:51:53:
前面很乱，也没理出头绪，但是杂带很多肯定是温度不对了，先升高温度看看，如果是弥散的那种那可能是模板浓度太大了

谢谢！

做过温度梯度和模板浓度梯度。
温度再高就P不出了，
模板浓度稀释后，影响不大，目的带大小的条带还是很弱，杂带还是很多。
赞一下 回复此楼
4楼2010-10-26 10:32:30
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