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ap

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR求助,做不出来找不到原因 已有4人参与

做了两个多周的PCR了,非常郁闷。是以霉菌基因组为模板做PCR的。共设计了四对引物,PCR三个基因。(其中有一对引物是PCR基因加上它上下游的)。发现都没有目的带。

1,模板质量应该没问题,跑过电泳,电泳大小在12K左右;OD600:OD800=1.81
2,引物设计,用Primer Premier设计的,有三组引物得分很高,与模板配对的引物长度为17~~20bp
3,PCR酶,DNTP,buffer没问题。用其他模板引物做过阳性对照,所以PCR得不到目的片段肯定是模板或引物的问题。

PCR产物杂带很多,曾经对大小差不多的条带回收酶切验证,仍然得不到目的基因。是不是还是引物的问题?我应该如何设计下一阶段的实验方案?

谢谢!
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ap

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 12:11:08:

菌给错了的可能性不大吧,这样就太神奇了

以前设计的引物是用Primer premier5设计的,得分都挺高啊。可是就是杂带很多,没有目的带
9楼2010-10-26 12:49:15
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amilie030312

金虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-26 10:55:09
前面很乱,也没理出头绪,但是杂带很多肯定是温度不对了,先升高温度看看,如果是弥散的那种那可能是模板浓度太大了
2楼2010-10-26 09:51:53
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yixuanwin

铁杆木虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-10-26 10:55:24
1   用已知序列设计引物还是近缘序列设计引物

2   不同pcr退火温度  dntp用量 延伸温度都不一样。 你的对照如何做的。

3   既然有序列报道 尝试用报道序列提供的引物
3楼2010-10-26 09:57:03
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ap

金虫 (正式写手)

引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2010-10-26 09:51:53:
前面很乱,也没理出头绪,但是杂带很多肯定是温度不对了,先升高温度看看,如果是弥散的那种那可能是模板浓度太大了

谢谢!

做过温度梯度和模板浓度梯度。
温度再高就P不出了,
模板浓度稀释后,影响不大,目的带大小的条带还是很弱,杂带还是很多。
4楼2010-10-26 10:32:30
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