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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题

个人目前做酿酒酵母过表达的研究，由于所用质粒上的筛选标记是URA3(尿嘧啶)营养缺陷，而目标菌株是工业二倍体酵母。所以就根据文献利用5-FOA (5-氟乳清酸)通过PCR产物(两端带有URA3同源片段，中间为G418筛选标记的PCR产物)方法直接转化工业二倍体酵母， 一开始5-FOA浓度为0.2mg/ml 和2mg/ml 结果高浓度的平板不长，低浓度5-FOA的平板长满； 后来用利用YPD加G418筛选，结果利用SD/SD-URA培养基验证时发现都能生长；
   接下来先测定了二倍体酵母5-FOA的抗性，发现0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生长， 现在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板来筛选，结果在1mg/ml 5-FOA G418浓度为120ug/ml 平板上长出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培养基验证时发现又全部能够生长，正常情况应该是SD不生长，只有补加URA3的SD才能生长。 请问各位虫友我的问题出在哪里？是不是应该将酵母单倍体话后再转化啊？
  比较啰嗦 见谅！  谢谢帮忙
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1楼2011-01-13 09:13:08
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冰艺于欣然

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2楼: Originally posted by susizheng at 2011-01-13 09:41:17
1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/S ...

我要用酿酒酵母做基因的过表达，老师说我们现在的菌株是工业菌株，是二倍体，不太好做，我最近在网上查菌株呢。ATCC 204508是很多突变株的亲代菌株，那是不是是二倍体啊？还有很多文献用到Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D，可是我在网上都查不到哪儿有卖的。。。您知道什么单倍体菌株比较适合做过表达的么？我刚接课题，很菜鸟，请见谅啊。。。
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18楼2013-11-08 10:20:49
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冰艺于欣然

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20楼: Originally posted by 三蛰 at 2014-01-10 15:25:58
你确定BY4741是两倍体？...

是单倍体，模式菌吧~~
亲，想问下，BY4741的基因组，除了敲除的几个基因，是不是都和S288C一样啊？它是模式菌，可是在NCBI上找不到它的基因组哎
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23楼2014-09-23 17:09:30
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