24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

应助: 10 (幼儿园)
金币: 20473.8
帖子: 1109
在线: 61.1小时
虫号: 481086

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题

个人目前做酿酒酵母过表达的研究，由于所用质粒上的筛选标记是URA3(尿嘧啶)营养缺陷，而目标菌株是工业二倍体酵母。所以就根据文献利用5-FOA (5-氟乳清酸)通过PCR产物(两端带有URA3同源片段，中间为G418筛选标记的PCR产物)方法直接转化工业二倍体酵母，一开始5-FOA浓度为0.2mg/ml 和2mg/ml 结果高浓度的平板不长，低浓度5-FOA的平板长满；后来用利用YPD加G418筛选，结果利用SD/SD-URA培养基验证时发现都能生长；
接下来先测定了二倍体酵母5-FOA的抗性，发现0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生长，现在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板来筛选，结果在1mg/ml 5-FOA G418浓度为120ug/ml 平板上长出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培养基验证时发现又全部能够生长，正常情况应该是SD不生长，只有补加URA3的SD才能生长。请问各位虫友我的问题出在哪里？是不是应该将酵母单倍体话后再转化啊？
比较啰嗦见谅！谢谢帮忙

回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

URA3敲除

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

有关卡那霉素使用浓度的问题已经有3人回复
求助一下，关于基因命名已经有3人回复
酵母基因敲除回补实验已经有9人回复
酿酒酵母基因敲除敲除盒的构建已经有7人回复
求助酿酒酵母转化溶液配制问题已经有9人回复
酿酒酵母基因敲除实验顺利需多少时间已经有22人回复
原核基因敲除抗性基因的问题已经有4人回复
链霉菌基因敲除怪现象已经有32人回复
关于酵母抗zeocin时间问题已经有9人回复
求助一个关于酿酒酵母转化的问题已经有19人回复
基因敲除转化子验证已经有5人回复
酿酒酵母的纯培养已经有5人回复
质粒上的基因敲除与染色体上的基因敲除有什么区别吗？已经有8人回复
重组酿酒酵母转化子筛选的问题已经有12人回复
20金币求助关于酿酒酵母的放大培养已经有9人回复
【求助/交流】抗生素筛选已经有19人回复
【求助/交流】基因敲除试验已经有23人回复
【讨论】3-溴丙烯是否有基因毒性？已经有4人回复
【求助/交流】基因敲除后的回补实验，如何确定基因的上游和下游的调节区？已经有4人回复
【求助/交流】酿酒酵母老长出粉红色菌落已经有10人回复
【求助/交流】酿酒酵母利用半乳糖的问题已经有13人回复
【求助/交流】酿酒酵母表达载体的构建问题已经有6人回复
【求助/交流】基因敲除时的同源双交换原理是什么？已经有9人回复
【求助/交流】酿酒酵母的乙醇最大耐受浓度已经有7人回复
【求助/交流】过滤除菌的问题已经有21人回复
【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题已经有6人回复

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴

1楼 2011-01-13 09:13:08

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

冰艺于欣然

新虫 (小有名气)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 1762.8
帖子: 110
在线: 12.2小时
虫号: 1551546

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

引用回帖:

2楼: Originally posted by susizheng at 2011-01-13 09:41:17
1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/S ...

我要用酿酒酵母做基因的过表达，老师说我们现在的菌株是工业菌株，是二倍体，不太好做，我最近在网上查菌株呢。ATCC 204508是很多突变株的亲代菌株，那是不是是二倍体啊？还有很多文献用到Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-7D，可是我在网上都查不到哪儿有卖的。。。您知道什么单倍体菌株比较适合做过表达的么？我刚接课题，很菜鸟，请见谅啊。。。

赞一下

回复此楼

18楼2013-11-08 10:20:49

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

查看全部 31 个回答

susizheng

木虫 (著名写手)

★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:09:58
xtcao668(金币+1): 2011-01-13 10:18:20

1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/SD-URA，说明只敲除了一半，要重新设计引物二次敲除。
2、最好不要选取工业二倍体酵母作为实验酵母，分子操作上会很麻烦，最好选用试验用的单倍体酵母。
3、酿酒酵母dropout类型现在又很多了，搞到一个URA3缺陷型的菌株也不难，何必自己敲除，费时又费力。

赞一下(1人)

回复此楼

2楼2011-01-13 09:41:17

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖