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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题

个人目前做酿酒酵母过表达的研究，由于所用质粒上的筛选标记是URA3(尿嘧啶)营养缺陷，而目标菌株是工业二倍体酵母。所以就根据文献利用5-FOA (5-氟乳清酸)通过PCR产物(两端带有URA3同源片段，中间为G418筛选标记的PCR产物)方法直接转化工业二倍体酵母， 一开始5-FOA浓度为0.2mg/ml 和2mg/ml 结果高浓度的平板不长，低浓度5-FOA的平板长满； 后来用利用YPD加G418筛选，结果利用SD/SD-URA培养基验证时发现都能生长；
   接下来先测定了二倍体酵母5-FOA的抗性，发现0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生长， 现在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板来筛选，结果在1mg/ml 5-FOA G418浓度为120ug/ml 平板上长出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培养基验证时发现又全部能够生长，正常情况应该是SD不生长，只有补加URA3的SD才能生长。 请问各位虫友我的问题出在哪里？是不是应该将酵母单倍体话后再转化啊？
  比较啰嗦 见谅！  谢谢帮忙
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1楼 2011-01-13 09:13:08
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jiaoxiayoulu

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URA3基因编码尿嘧啶合成途径中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）转变为细胞毒性物质， 使细胞无法生长。
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10楼2013-03-20 19:46:53
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jiaoxiayoulu

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请问，你G418筛选产物是不是就是neo基因啊？
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11楼2013-04-02 19:57:05
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jiaoxiayoulu

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请问，G418筛选产物是不是就是neo基因啊？
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12楼2013-04-02 19:59:14
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