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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题

个人目前做酿酒酵母过表达的研究，由于所用质粒上的筛选标记是URA3(尿嘧啶)营养缺陷，而目标菌株是工业二倍体酵母。所以就根据文献利用5-FOA (5-氟乳清酸)通过PCR产物(两端带有URA3同源片段，中间为G418筛选标记的PCR产物)方法直接转化工业二倍体酵母， 一开始5-FOA浓度为0.2mg/ml 和2mg/ml 结果高浓度的平板不长，低浓度5-FOA的平板长满； 后来用利用YPD加G418筛选，结果利用SD/SD-URA培养基验证时发现都能生长；
   接下来先测定了二倍体酵母5-FOA的抗性，发现0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生长， 现在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板来筛选，结果在1mg/ml 5-FOA G418浓度为120ug/ml 平板上长出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培养基验证时发现又全部能够生长，正常情况应该是SD不生长，只有补加URA3的SD才能生长。 请问各位虫友我的问题出在哪里？是不是应该将酵母单倍体话后再转化啊？
  比较啰嗦 见谅！  谢谢帮忙
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1楼2011-01-13 09:13:08
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三蛰

铜虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
19楼: Originally posted by susizheng at 2013-11-08 11:17:07
你好，做酿酒酵母好像是三四年前的事了，二倍体做基因敲除是麻烦。但是做过表达并不影响啊。用二倍体做一样的，即使转进去一半一样可以表达。另外我只用过WT strain (BY4741 )这个菌株，也是二倍体的。...

你确定BY4741是两倍体？
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20楼2014-01-10 15:25:58
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