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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】酿酒酵母URA3基因敲除的问题

个人目前做酿酒酵母过表达的研究，由于所用质粒上的筛选标记是URA3(尿嘧啶)营养缺陷，而目标菌株是工业二倍体酵母。所以就根据文献利用5-FOA (5-氟乳清酸)通过PCR产物(两端带有URA3同源片段，中间为G418筛选标记的PCR产物)方法直接转化工业二倍体酵母，一开始5-FOA浓度为0.2mg/ml 和2mg/ml 结果高浓度的平板不长，低浓度5-FOA的平板长满；后来用利用YPD加G418筛选，结果利用SD/SD-URA培养基验证时发现都能生长；
接下来先测定了二倍体酵母5-FOA的抗性，发现0.5mg/ml ,1mg/ml 不能生长，现在利用SD-URA-5-FOA-G418 平板来筛选，结果在1mg/ml 5-FOA G418浓度为120ug/ml 平板上长出菌落，但是再次利用SD/SD-URA 培养基验证时发现又全部能够生长，正常情况应该是SD不生长，只有补加URA3的SD才能生长。请问各位虫友我的问题出在哪里？是不是应该将酵母单倍体话后再转化啊？
比较啰嗦见谅！谢谢帮忙

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1楼2011-01-13 09:13:08

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chrqrq09

铁虫 (初入文坛)

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★
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引用回帖:

2楼: Originally posted by susizheng at 2011-01-13 09:41:17
1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/S ...

我就有点不理解了，为什么采用同源臂来敲除S.cerevisiae的ura3基因后，转化子能在含有2mg/ml的FOA的YPD固体平板上生长，而不敲除的对照是不能生长的，说明ura3基因是被破坏的，不然表达的产物能将FOA转化为有毒的产物，导致不能生长，但转化子却能在含有FOA上生长（2mg/ml）。但是再转接到YNB不加尿嘧啶的平板上，却又能生长，说明ura3基因又没有被破坏，要是破坏了，在YNB不含尿嘧啶的平时上是不能生长的。
2楼认为是二倍体的话，若敲除的是其中的一个ura3基因，那么在含有2mg/ml的FOA平板上照样也是不能生长的，因为没有被敲除的这个ura3基因仍会表达并将FOA分解成有毒的产物，导致转化子不能生长。以二倍体来解释为什么转化子在YNB不加尿嘧啶的平板上能生长是解释的通的，但无法解释为什么仍能在含有FOA的平板上生长。
我做其它的酵母，比如Yarrowia lipolytica也遇到同样的问题。

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26楼2015-05-12 09:59:02

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susizheng

木虫 (著名写手)

★ ★
rainwander(金币+2):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-13 10:09:58
xtcao668(金币+1): 2011-01-13 10:18:20

1、竟然是二倍体，你敲除的时候可能只是敲除了一半，因此一开始用SD/SD-URA筛选肯定的不容易得到预期结果，应该一开始用高浓度抗生素筛选，通过抗生素筛选后，再用SD/SD-URA筛选，如果通过抗生素筛选后不能通过SD/SD-URA，说明只敲除了一半，要重新设计引物二次敲除。
2、最好不要选取工业二倍体酵母作为实验酵母，分子操作上会很麻烦，最好选用试验用的单倍体酵母。
3、酿酒酵母dropout类型现在又很多了，搞到一个URA3缺陷型的菌株也不难，何必自己敲除，费时又费力。

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2楼2011-01-13 09:41:17

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