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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】酿酒酵母真核表达载体构建和连接的问题已有4人参与

各位网友，目前在做酿酒酵母表达，我外源基因片段酶切位点在我用的真核表达载体pYX212上没有合适位点。但是，由于该表达载体上有限制性酶EcoR V 的酶切位点，我用EcoR V 酶切后72摄氏度加dTTP两个小时，经琼脂糖凝胶电泳或者酚氯仿沉淀后，按载体：外源基因=1-(3~7)加T4酶连接过夜后先转化感受态大肠杆菌，但是做过多次均是载体自连(经双酶切鉴定)；并且载体：外源基因=1：10 也做过，还将载体先在45度上保温后再加T4酶和buffer，结果也是载体自连。
特来求助，用碱性磷酸酶去磷酸化处理去磷酸化是不是可以避免载体自连？去磷酸化后要凝胶回收吗（凝胶回收效率很低）？还有就是去磷酸化后连接时需要加入ATP吗？(一般是载体、外源基因、T4酶、T4 buffer) 希望做过的网友支持一下。

抱歉，有点长，谢谢啦！

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