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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 目的片段与表达载体的连接
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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 目的片段与表达载体的连接

1kb的目的片段与PET-19b连接，转化DH5a，平板培养16小时无菌落。做了空载体转化的对照，14小时平板菌落长得很好，也就是问题出在连接，怎么优化连接呢，有什么需要注意的？
PS: 连接体系 14μl 目的片段，3μl 酶切载体，2μl buffer，1μl T4连接酶。（带有目的片段的T载体和PET载体都是用试剂盒提，使用相同的酶切体系）
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1楼 2011-11-02 10:48:22
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wcwluwei at 2011-11-02 21:18:11:
你这种情况吧，我觉得是你的DNA量加多了，以前遇到这种情况过，把模板量适当减小，剩余部分用dd水补上

量多也不至于一个都没连上吧，一个菌落都不长，悲催啊~先试试减少DNA的量，希望有好消息啦，多谢啦
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9楼2011-11-02 21:48:17
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助回帖!应助更多有奖励! 2011-11-02 11:44:47
连接前应该跑个琼脂糖确定目的基因和载体之间的浓度比，在通过计算使得两者摩尔量之比在8：1左右。
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
2楼2011-11-02 10:54:15
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笔冰河

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2011-11-02 10:54:15:
连接前应该跑个琼脂糖确定目的基因和载体之间的浓度比，在通过计算使得两者摩尔量之比在8：1左右。

跑了电泳，亮度差不多，是按目的片段：载体摩尔比约为10:1连接，试了两次就是长不出来，不知道是哪里出了问题
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3楼2011-11-02 11:39:02
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imyting

至尊木虫 (正式写手)
★
wanhscn(金币+1): 热心! 2011-11-02 12:06:26
是不是酶切出问题了啊，你质粒酶切后跑胶有几条带，是双酶切还单酶切？
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悠哉游哉做实验，成兮败兮我随便
4楼2011-11-02 11:49:24
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