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笔冰河

银虫 (小有名气)

[求助] 目的片段与表达载体的连接

1kb的目的片段与PET-19b连接,转化DH5a,平板培养16小时无菌落。做了空载体转化的对照,14小时平板菌落长得很好,也就是问题出在连接,怎么优化连接呢,有什么需要注意的?
PS: 连接体系 14μl 目的片段,3μl 酶切载体,2μl buffer,1μl T4连接酶。(带有目的片段的T载体和PET载体都是用试剂盒提,使用相同的酶切体系)
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笔冰河

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by imyting at 2011-11-02 10:54:15:
连接前应该跑个琼脂糖确定目的基因和载体之间的浓度比,在通过计算使得两者摩尔量之比在8:1左右。

跑了电泳,亮度差不多,是按目的片段:载体摩尔比约为10:1连接,试了两次就是长不出来,不知道是哪里出了问题
3楼2011-11-02 11:39:02
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imyting

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助回帖!应助更多有奖励! 2011-11-02 11:44:47
连接前应该跑个琼脂糖确定目的基因和载体之间的浓度比,在通过计算使得两者摩尔量之比在8:1左右。
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
2楼2011-11-02 10:54:15
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imyting

至尊木虫 (正式写手)


wanhscn(金币+1): 热心! 2011-11-02 12:06:26
是不是酶切出问题了啊,你质粒酶切后跑胶有几条带,是双酶切还单酶切?
悠哉游哉做实验,成兮败兮我随便
4楼2011-11-02 11:49:24
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笔冰河

银虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by imyting at 2011-11-02 11:49:24:
是不是酶切出问题了啊,你质粒酶切后跑胶有几条带,是双酶切还单酶切?

双酶切,表达载体酶切只有一条带,位置正确
5楼2011-11-02 18:18:30
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