应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段DNA如何连接载体
221/3返回列表123下一页
查看: 3749  |  回复: 21
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

dzwd

金虫 (小有名气)

[求助] 长片段DNA如何连接载体

4900bp长度 DNA 片段，我用的是TAKARA,PMD19-T载体进行连接，连接数小时，但是在筛选蓝白菌斑的时候，菌落白斑过少，不知道是什么原因，并且菌落PCR后无条带，总是连接不上。。希望能得到解答，谢谢！！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-08-12 10:45:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 16:18:59
dzwd(金币+2): 2011-08-13 22:48:22
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:35
1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾？如果没有酶切干净，那么很影响下游的连接实验；纯化也很重要，一定要纯化干净，不然杂质会影响连接酶的效率以及连接的成功率；
3：连接体系中，因为基因比载体大一些，所以可以将载体适当多加一些，当然了，这要看两者的浓度了，相信楼主这一点应该可以自己定夺！
4：板子上长出来白色单克隆，可以挑到另外的板子上划线，然后PCR验证，当然了，正如楼主所说，PCR没有P出来，但是很有可能是你已经连接上了，但是只是做PCR没有扩增出来而已，因为你的基因有些大，你做PCR，可以延伸5min，30个循环，尝试一下，一般板子上长出来的白色单克隆十有八九都是对的。。。所以就是缺少验证而已，当然了，即便PCR没有做出来，你也可以提质粒，酶切呀，这样更加直接一些。。。
祝你好运！
赞一下(3人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
13楼2011-08-12 12:31:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追梦草

新虫 (初入文坛)
我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。
赞一下(1人) 回复此楼
19楼2013-08-05 23:18:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

dzwd(金币+1): 2011-08-13 22:48:56
楼主的DNA片段浓度太小吧！
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
2楼2011-08-12 10:48:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): Good！7K多，不错嘛！ 2011-08-12 18:17:36
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！
赞一下(2人) 回复此楼
jiayoubashaonian
3楼2011-08-12 10:50:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:50:20:
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！

你们在连接载体的时候，用了多少ul的目的片段呢
赞一下 回复此楼
4楼2011-08-12 10:51:54
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:50:20:
我们曾今做过7.3k的连接，将目的片段浓度调节的特别大，最后加了100ul感受态，板子长的时间长些！

您是说我的平板要培养时间长一些是么，我是培养14个小时，那您认为大概多久为好呢，谢谢
赞一下 回复此楼
5楼2011-08-12 10:53:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dzwd at 2011-08-12 10:51:54:
你们在连接载体的时候，用了多少ul的目的片段呢

我们用的全式金的，载体1ul，目的片段3.5ul。
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
6楼2011-08-12 10:54:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:48:20:
楼主的DNA片段浓度太小吧！

不好意思，那您认为多大浓度为好呢，我不是很明白，您能在说清楚一些么
赞一下 回复此楼
7楼2011-08-12 10:55:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 有道理！ 2011-08-12 18:17:52
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:17
大片段连接就是很难的，但是一直坚持做几天总会成功的。另外菌检的时候尽量扩增片段在2000bp一下，实在扩不出来就挑几个摇菌提质粒酶切验证。
赞一下(1人) 回复此楼
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
8楼2011-08-12 10:55:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 热心 2011-08-12 18:18:01
当时我们是根据Marker大体估计了一下，浓度有16-20ng/ul左右！
赞一下(1人) 回复此楼
jiayoubashaonian
9楼2011-08-12 10:56:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:56:39:
当时我们是根据Marker大体估计了一下，浓度有16-20ng/ul左右！

您平板培养大概多少时间，我是14个小时
赞一下 回复此楼
10楼2011-08-12 10:59:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 学员x4ipC2 的主题更新
221/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +6 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 9/450 2026-08-29 11:18 by jCd0dEvKHShX
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +14 晴天加油 2026-08-26 15/750 2026-08-29 11:06 by biily
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-29 10:18 by winsaint
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-29 09:49 by G6APbkg8SA6w
[找工作] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ASdOkHsho7FD 2026-08-28 5/250 2026-08-29 09:28 by G6APbkg8SA6w
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[教师之家] 导师吐槽：我怎么摊上了这么个极品研究生！ +8 苏东坡二世 2026-08-23 8/400 2026-08-28 14:41 by lkforward
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +4 gdd2018 2026-08-28 9/450 2026-08-28 14:22 by jklily
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +5 yuleib84 2026-08-26 6/300 2026-08-28 00:02 by yudaoqian88
[基金申请] 面上合作单位盖章 +5 ssyjh 2026-08-27 5/250 2026-08-27 20:50 by gdfollow
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 没有任何消息-是不是就凉了 +9 图啦图啦 2026-08-24 10/500 2026-08-25 11:59 by 南海小哥
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭