【答案】应助回帖

jiayoubashaonian

11楼2011-08-12 11:01:58

小七咯

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【答案】应助回帖

这个载体能容纳的片段有这么大吗？还有，你PCR检测的时候，最好就重新设计一段引物，上游在载体上，下游在目的片段上，大概1000bp，这样子检测会方便许多

12楼2011-08-12 12:24:42

天使托

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 16:18:59
dzwd(金币+2): 2011-08-13 22:48:22
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:35

1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾？如果没有酶切干净，那么很影响下游的连接实验；纯化也很重要，一定要纯化干净，不然杂质会影响连接酶的效率以及连接的成功率；
3：连接体系中，因为基因比载体大一些，所以可以将载体适当多加一些，当然了，这要看两者的浓度了，相信楼主这一点应该可以自己定夺！
4：板子上长出来白色单克隆，可以挑到另外的板子上划线，然后PCR验证，当然了，正如楼主所说，PCR没有P出来，但是很有可能是你已经连接上了，但是只是做PCR没有扩增出来而已，因为你的基因有些大，你做PCR，可以延伸5min，30个循环，尝试一下，一般板子上长出来的白色单克隆十有八九都是对的。。。所以就是缺少验证而已，当然了，即便PCR没有做出来，你也可以提质粒，酶切呀，这样更加直接一些。。。
祝你好运！

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13楼2011-08-12 12:31:35

dzwd

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引用回帖:

13楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 12:31:35:
1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾 ...

谢谢您的回复非常感谢！

14楼2011-08-12 13:59:24

dzwd

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11楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 11:01:58:
时间也差不多，头一天晚上八九点钟到第二天中午左右，就长了约有20几个斑，全部挑了做的菌落PCR，12个阳性克隆，对了扩片段时用的Takara的primer star，保真性还行！

您用的全式金的哪个载体呢？我打算用一下试试

15楼2011-08-12 14:00:31

blackrose8089

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15楼: Originally posted by dzwd at 2011-08-12 14:00:31:
您用的全式金的哪个载体呢？我打算用一下试试

用的TRANS T1 blunt ，钝末端，感受态Trans T1，好像感受态是随着送一包！楼主可以咨询一下，这段时间一直在做生理实验，不知他们那里是否有所变动？

jiayoubashaonian

16楼2011-08-12 14:33:58

xbl3688

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励新虫 2011-08-12 18:18:45

我们虽然没连接过这么大的目的片段，但连过2700bp、1500bp的，一般采用目的片段与载体的比例为7:1，连接可以适当延长一个到两个小时。尽量不要扩4900bp的全片段，找小一点的特意片段会容易一些。

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17楼2011-08-12 14:52:35

凉亭

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1183146楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:54:11
我们用的全式金的，载体1ul，目的片段3.5ul。...

目的片段和载体的连接不是要摩尔比3:1-6:1吗我现在连接一个6kb片段到质粒一直没有连接上能不能请教你一下操作时有什么要注意的吗

18楼2012-07-11 10:18:22

追梦草

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我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。

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19楼2013-08-05 23:18:52

猫di阁楼

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19楼: Originally posted by 追梦草 at 2013-08-05 23:18:52
我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。

我的片段也是差不多4000
请问你也是连T载体吗？听说片段大小比载体大就会连不上是吗？

20楼2013-11-12 15:17:00