应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段DNA如何连接载体
222/3返回列表上一页123下一页
查看: 3654  |  回复: 21
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-08-12 18:18:19
时间也差不多，头一天晚上八九点钟到第二天中午左右，就长了约有20几个斑，全部挑了做的菌落PCR，12个阳性克隆，对了扩片段时用的Takara的primer star，保真性还行！
赞一下(1人) 回复此楼
jiayoubashaonian
11楼2011-08-12 11:01:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

小七咯

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这个载体能容纳的片段有这么大吗？还有，你PCR检测的时候，最好就重新设计一段引物，上游在载体上，下游在目的片段上，大概1000bp，这样子检测会方便许多
赞一下 回复此楼
12楼2011-08-12 12:24:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 16:18:59
dzwd(金币+2): 2011-08-13 22:48:22
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:35
1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾？如果没有酶切干净，那么很影响下游的连接实验；纯化也很重要，一定要纯化干净，不然杂质会影响连接酶的效率以及连接的成功率；
3：连接体系中，因为基因比载体大一些，所以可以将载体适当多加一些，当然了，这要看两者的浓度了，相信楼主这一点应该可以自己定夺！
4：板子上长出来白色单克隆，可以挑到另外的板子上划线，然后PCR验证，当然了，正如楼主所说，PCR没有P出来，但是很有可能是你已经连接上了，但是只是做PCR没有扩增出来而已，因为你的基因有些大，你做PCR，可以延伸5min，30个循环，尝试一下，一般板子上长出来的白色单克隆十有八九都是对的。。。所以就是缺少验证而已，当然了，即便PCR没有做出来，你也可以提质粒，酶切呀，这样更加直接一些。。。
祝你好运！
赞一下(3人) 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
13楼2011-08-12 12:31:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 12:31:35:
1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾 ...

谢谢您的回复非常感谢！
赞一下 回复此楼
14楼2011-08-12 13:59:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 11:01:58:
时间也差不多，头一天晚上八九点钟到第二天中午左右，就长了约有20几个斑，全部挑了做的菌落PCR，12个阳性克隆，对了扩片段时用的Takara的primer star，保真性还行！

您用的全式金的哪个载体呢？我打算用一下试试
赞一下 回复此楼
15楼2011-08-12 14:00:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by dzwd at 2011-08-12 14:00:31:
您用的全式金的哪个载体呢？我打算用一下试试

用的TRANS T1 blunt ， 钝末端，感受态Trans T1， 好像感受态是随着送一包！楼主可以咨询一下，这段时间一直在做生理实验，不知他们那里是否有所变动？
赞一下 回复此楼
jiayoubashaonian
16楼2011-08-12 14:33:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励新虫 2011-08-12 18:18:45
我们虽然没连接过这么大的目的片段，但连过2700bp、1500bp的，一般采用目的片段与载体的比例为7:1，连接可以适当延长一个到两个小时。尽量不要扩4900bp的全片段，找小一点的特意片段会容易一些。
赞一下(1人) 回复此楼
生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
17楼2011-08-12 14:52:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凉亭

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1183146楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:54:11
我们用的全式金的，载体1ul，目的片段3.5ul。...

目的片段和载体的连接不是要摩尔比3:1-6:1吗 我现在连接一个6kb片段到质粒 一直没有连接上 能不能请教你一下 操作时有什么要注意的吗
赞一下 回复此楼
18楼2012-07-11 10:18:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

追梦草

新虫 (初入文坛)
我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。
赞一下(1人) 回复此楼
19楼2013-08-05 23:18:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 追梦草 at 2013-08-05 23:18:52
我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。

我的片段也是差不多4000
请问你也是连T载体吗？听说片段大小比载体大就会连不上是吗？
赞一下 回复此楼
20楼2013-11-12 15:17:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 学员x4ipC2 的主题更新
222/3返回列表上一页123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] fileCode有新解读？ +5 Tide man 2026-08-08 7/350 2026-08-08 09:25 by 超级海虾
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 5/250 2026-08-08 08:59 by 6vVgjDL4CnGu
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 4/200 2026-08-08 08:27 by 6vVgjDL4CnGu
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HEQlVqMTIA7d 2026-08-07 3/150 2026-08-08 03:47 by 6vVgjDL4CnGu
[基金申请] 基金中了 +14 laoda193707 2026-08-06 14/700 2026-08-08 00:23 by 实验小白ha
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 娱乐 +6 Tide man 2026-08-03 6/300 2026-08-07 22:40 by 铁帽子农民
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +9 且听虎啸 2026-08-07 12/600 2026-08-07 21:53 by 理想三旬2025
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] 听说今天filecode变了 +24 布布和一二 2026-08-06 47/2350 2026-08-07 16:02 by zhiyanjiang
[基金申请] filecode与中标关系的预测 +3 布布和一二 2026-08-07 3/150 2026-08-07 15:09 by gltch
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[论文投稿] 十年后又回来了，论文投稿求助 +4 哈哈114477 2026-08-01 4/200 2026-08-07 14:39 by jgy194592
[基金申请] 关于豆爷回答的JTJC与%2F数量 +4 yang182083 2026-08-06 6/300 2026-08-07 12:43 by 虫友是什么虫
[基金申请] filecode +14 等待解的谜 2026-08-06 19/950 2026-08-07 12:20 by wlwhappy
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭