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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 长片段DNA如何连接载体
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜(金币+2): good 2011-08-12 18:18:19
时间也差不多，头一天晚上八九点钟到第二天中午左右，就长了约有20几个斑，全部挑了做的菌落PCR，12个阳性克隆，对了扩片段时用的Takara的primer star，保真性还行！
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jiayoubashaonian
11楼2011-08-12 11:01:58
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小七咯

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这个载体能容纳的片段有这么大吗？还有，你PCR检测的时候，最好就重新设计一段引物，上游在载体上，下游在目的片段上，大概1000bp，这样子检测会方便许多
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12楼2011-08-12 12:24:42
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 16:18:59
dzwd(金币+2): 2011-08-13 22:48:22
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:35
1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾？如果没有酶切干净，那么很影响下游的连接实验；纯化也很重要，一定要纯化干净，不然杂质会影响连接酶的效率以及连接的成功率；
3：连接体系中，因为基因比载体大一些，所以可以将载体适当多加一些，当然了，这要看两者的浓度了，相信楼主这一点应该可以自己定夺！
4：板子上长出来白色单克隆，可以挑到另外的板子上划线，然后PCR验证，当然了，正如楼主所说，PCR没有P出来，但是很有可能是你已经连接上了，但是只是做PCR没有扩增出来而已，因为你的基因有些大，你做PCR，可以延伸5min，30个循环，尝试一下，一般板子上长出来的白色单克隆十有八九都是对的。。。所以就是缺少验证而已，当然了，即便PCR没有做出来，你也可以提质粒，酶切呀，这样更加直接一些。。。
祝你好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
13楼2011-08-12 12:31:35
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dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-12 12:31:35:
1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾 ...

谢谢您的回复非常感谢！
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14楼2011-08-12 13:59:24
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dzwd

金虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 11:01:58:
时间也差不多，头一天晚上八九点钟到第二天中午左右，就长了约有20几个斑，全部挑了做的菌落PCR，12个阳性克隆，对了扩片段时用的Takara的primer star，保真性还行！

您用的全式金的哪个载体呢？我打算用一下试试
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15楼2011-08-12 14:00:31
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by dzwd at 2011-08-12 14:00:31:
您用的全式金的哪个载体呢？我打算用一下试试

用的TRANS T1 blunt ， 钝末端，感受态Trans T1， 好像感受态是随着送一包！楼主可以咨询一下，这段时间一直在做生理实验，不知他们那里是否有所变动？
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jiayoubashaonian
16楼2011-08-12 14:33:58
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励新虫 2011-08-12 18:18:45
我们虽然没连接过这么大的目的片段，但连过2700bp、1500bp的，一般采用目的片段与载体的比例为7:1，连接可以适当延长一个到两个小时。尽量不要扩4900bp的全片段，找小一点的特意片段会容易一些。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
17楼2011-08-12 14:52:35
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凉亭

银虫 (小有名气)
引用回帖:
1183146楼: Originally posted by blackrose8089 at 2011-08-12 10:54:11
我们用的全式金的，载体1ul，目的片段3.5ul。...

目的片段和载体的连接不是要摩尔比3:1-6:1吗 我现在连接一个6kb片段到质粒 一直没有连接上 能不能请教你一下 操作时有什么要注意的吗
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18楼2012-07-11 10:18:22
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追梦草

新虫 (初入文坛)
我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。
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19楼2013-08-05 23:18:52
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猫di阁楼

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
19楼: Originally posted by 追梦草 at 2013-08-05 23:18:52
我前一段时间连了3900bp的片段，PCR产物回收后浓度400ng/ul，16度连了14h,最后连上了。大片段就是不好连，如果能保证操作没问题的话，就尽量提高浓度和连接时间，这样连上的几率会大些。

我的片段也是差不多4000
请问你也是连T载体吗？听说片段大小比载体大就会连不上是吗？
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20楼2013-11-12 15:17:00
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