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dzwd

金虫 (小有名气)

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[求助] 长片段DNA如何连接载体

4900bp长度 DNA 片段，我用的是TAKARA,PMD19-T载体进行连接，连接数小时，但是在筛选蓝白菌斑的时候，菌落白斑过少，不知道是什么原因，并且菌落PCR后无条带，总是连接不上。。希望能得到解答，谢谢！！

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1楼2011-08-12 10:45:43

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天使托

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T.Shen

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4, MolEPI+1): Good！ 2011-08-12 16:18:59
dzwd(金币+2): 2011-08-13 22:48:22
dzwd(金币+1): 2011-08-15 07:35:35

1：基因4.9kb，相对于PMD19（不到3K）来说确实有些大了，但是并不表示不好连接，如果酶切，连接体系合适，连接上还是可以的；
2：楼主的基因和载体是否酶切完全，并且纯化干净，所谓酶切完全，酶切的时候有无拖尾？如果没有酶切干净，那么很影响下游的连接实验；纯化也很重要，一定要纯化干净，不然杂质会影响连接酶的效率以及连接的成功率；
3：连接体系中，因为基因比载体大一些，所以可以将载体适当多加一些，当然了，这要看两者的浓度了，相信楼主这一点应该可以自己定夺！
4：板子上长出来白色单克隆，可以挑到另外的板子上划线，然后PCR验证，当然了，正如楼主所说，PCR没有P出来，但是很有可能是你已经连接上了，但是只是做PCR没有扩增出来而已，因为你的基因有些大，你做PCR，可以延伸5min，30个循环，尝试一下，一般板子上长出来的白色单克隆十有八九都是对的。。。所以就是缺少验证而已，当然了，即便PCR没有做出来，你也可以提质粒，酶切呀，这样更加直接一些。。。
祝你好运！