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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲除的假阳性问题
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半夏今年

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除的假阳性问题 已有1人参与

本人做大肠的基因敲除实验，做了很多批，可是都是假阳性，操作步骤也都是按照文献上讲的，电转后涂卡纳平板，平板上会长，但菌落鉴定都不是重组菌，DpnⅠ也换过了，现在不知道哪里出了问题，求帮助啊~~~~~~~
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1楼 2013-06-08 19:02:28
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
1949stone: 金币+1, 鼓励 2013-06-09 14:20:16
用割胶去除模板，产物不够得话割胶后二次扩增。
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2楼2013-06-08 22:50:15
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
半夏今年(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-09 09:33:59
因为不清楚你的具体实验流程，我无法提供具体意见。但是提示一下：1.你的菌种是否适合电转化；2.敲出掉的基因会不会造成细菌很快挂掉或者无法用你的鉴别培养基鉴别出来或者至少无法富集；3.你的大场杆菌是否是在电转化过程中的电击操作是否合适？大了可能细胞挂了，小了可能没有转入。
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3楼2013-06-08 23:41:03
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半夏今年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-06-08 22:50:15
用割胶去除模板，产物不够得话割胶后二次扩增。

我PCR后做了一次胶回收，然后用DpnⅠ酶切后再胶回收，这样还是不能消除模板影响吗
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4楼2013-06-09 10:38:47
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
你的假阳性能提出原来的质粒么？

Kan应该很少有无缘无故长出来的假的
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5楼2013-06-09 11:43:45
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半夏今年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-06-09 11:43:45
你的假阳性能提出原来的质粒么？

Kan应该很少有无缘无故长出来的假的

我没有抽过质粒，不过我试试看
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6楼2013-06-09 15:03:26
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melisax

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-11 11:09:04
1.确定你的同源臂大小，虽然理论上是50bp就够了，但是如果同源臂同源性太好会容易打偏，我师兄是这么解释的
2. 我自己的经验是dpnI切过夜，然后电转，后培养过夜后离心，把菌溶200微左右全部涂一个板子上。我用的是慢切酶，曾经就是有次偷懒没切，电了2次都没阳性，切了之后终于有阳性了。
3. 我感觉还是凭运气，还有感受态问题吧，我感觉转一次到两次基本肯定会有，3次转不出来就重新做感受态继续电了，感受态挺重要的，长太过或者啥的影响挺大。
最后祝实验顺利，欢迎一起交流大肠杆菌敲除的问题。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2013-06-11 00:57:36
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半夏今年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by melisax at 2013-06-11 00:57:36
1.确定你的同源臂大小，虽然理论上是50bp就够了，但是如果同源臂同源性太好会容易打偏，我师兄是这么解释的
2. 我自己的经验是dpnI切过夜，然后电转，后培养过夜后离心，把菌溶200微左右全部涂一个板子上。我用的是 ...

谢谢了，我有几个问题：1、什么叫同源性太好容易打偏？难道不是同源性越高越好吗，我一直这么以为的，，，，，
2、电转后我是加1微升LB复苏，在EP管里面，一般复苏时间是2-3小时，如果过夜的话小EP管里的溶氧肯定不够的，这样可以吗？
3、感受态我一直是现做现用，我每次做都能长菌，但都是假阳性的
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8楼2013-06-13 09:57:34
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melisax

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
半夏今年(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物版块 期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-29 20:25:24
同源性太好。。。。我的意思是指你的同源臂跟除目的基因以外的基因也有同源性，然后结合效果更好，然后就重组到别的位置了。
我觉得你应该把你打靶片段再次确认下，我以前也是，片段出现问题，全部都是假阳性。敲除的话一般感受态影响不是特别大，还是跟片段有关系，你测个序吧
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9楼2013-06-13 21:39:25
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半夏今年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by melisax at 2013-06-13 21:39:25
同源性太好。。。。我的意思是指你的同源臂跟除目的基因以外的基因也有同源性，然后结合效果更好，然后就重组到别的位置了。
我觉得你应该把你打靶片段再次确认下，我以前也是，片段出现问题，全部都是假阳性。敲除 ...

恩，我也这么想过，打靶片段是不是结合到别的位置了，但是测序的话只能测出卡纳片段，没有同源臂的序列，怎样确定它与其他基因位置的同源性呢
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10楼2013-06-14 10:48:40
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