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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲除的假阳性问题
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半夏今年

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除的假阳性问题 已有1人参与

本人做大肠的基因敲除实验，做了很多批，可是都是假阳性，操作步骤也都是按照文献上讲的，电转后涂卡纳平板，平板上会长，但菌落鉴定都不是重组菌，DpnⅠ也换过了，现在不知道哪里出了问题，求帮助啊~~~~~~~
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1楼 2013-06-08 19:02:28
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melisax

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
半夏今年(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物版块 期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-29 20:25:24
同源性太好。。。。我的意思是指你的同源臂跟除目的基因以外的基因也有同源性，然后结合效果更好，然后就重组到别的位置了。
我觉得你应该把你打靶片段再次确认下，我以前也是，片段出现问题，全部都是假阳性。敲除的话一般感受态影响不是特别大，还是跟片段有关系，你测个序吧
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9楼2013-06-13 21:39:25
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
1949stone: 金币+1, 鼓励 2013-06-09 14:20:16
用割胶去除模板，产物不够得话割胶后二次扩增。
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2楼2013-06-08 22:50:15
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
半夏今年(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-09 09:33:59
因为不清楚你的具体实验流程，我无法提供具体意见。但是提示一下：1.你的菌种是否适合电转化；2.敲出掉的基因会不会造成细菌很快挂掉或者无法用你的鉴别培养基鉴别出来或者至少无法富集；3.你的大场杆菌是否是在电转化过程中的电击操作是否合适？大了可能细胞挂了，小了可能没有转入。
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3楼2013-06-08 23:41:03
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半夏今年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-06-08 22:50:15
用割胶去除模板，产物不够得话割胶后二次扩增。

我PCR后做了一次胶回收，然后用DpnⅠ酶切后再胶回收，这样还是不能消除模板影响吗
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4楼2013-06-09 10:38:47
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