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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 基因敲除的假阳性问题
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半夏今年

新虫 (初入文坛)

[求助] 基因敲除的假阳性问题 已有1人参与

本人做大肠的基因敲除实验，做了很多批，可是都是假阳性，操作步骤也都是按照文献上讲的，电转后涂卡纳平板，平板上会长，但菌落鉴定都不是重组菌，DpnⅠ也换过了，现在不知道哪里出了问题，求帮助啊~~~~~~~
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1楼 2013-06-08 19:02:28
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melisax

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-06-11 11:09:04
1.确定你的同源臂大小，虽然理论上是50bp就够了，但是如果同源臂同源性太好会容易打偏，我师兄是这么解释的
2. 我自己的经验是dpnI切过夜，然后电转，后培养过夜后离心，把菌溶200微左右全部涂一个板子上。我用的是慢切酶，曾经就是有次偷懒没切，电了2次都没阳性，切了之后终于有阳性了。
3. 我感觉还是凭运气，还有感受态问题吧，我感觉转一次到两次基本肯定会有，3次转不出来就重新做感受态继续电了，感受态挺重要的，长太过或者啥的影响挺大。
最后祝实验顺利，欢迎一起交流大肠杆菌敲除的问题。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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7楼2013-06-11 00:57:36
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
★
1949stone: 金币+1, 鼓励 2013-06-09 14:20:16
用割胶去除模板，产物不够得话割胶后二次扩增。
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2楼2013-06-08 22:50:15
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
半夏今年(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-06-09 09:33:59
因为不清楚你的具体实验流程，我无法提供具体意见。但是提示一下：1.你的菌种是否适合电转化；2.敲出掉的基因会不会造成细菌很快挂掉或者无法用你的鉴别培养基鉴别出来或者至少无法富集；3.你的大场杆菌是否是在电转化过程中的电击操作是否合适？大了可能细胞挂了，小了可能没有转入。
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3楼2013-06-08 23:41:03
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半夏今年

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Haibara_Ai at 2013-06-08 22:50:15
用割胶去除模板，产物不够得话割胶后二次扩增。

我PCR后做了一次胶回收，然后用DpnⅠ酶切后再胶回收，这样还是不能消除模板影响吗
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4楼2013-06-09 10:38:47
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