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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pGEM-T Easy载体 T-A 连接 为啥没连入PCR产物的 菌斑是蓝斑
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】pGEM-T Easy载体 T-A 连接 为啥没连入PCR产物的 菌斑是蓝斑

T载体如果不跟PCR产物连接， 不是由于T末端，自己不能自连吗? 这样不应该lacZ基因中间断裂 不能表达吗? 为什么没有连接PCR产物的菌班是蓝色的呢？
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1楼 2011-03-07 09:55:27
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阿修罗Axuro

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
rainwander(金币+2): 鼓励积极参与交流~~~ 2011-03-07 20:01:41
建议楼主好好看看蓝白斑的基本原理~~~~~~~
如果PCR产物插入了MCS位点，则LAZ基因被截断，不能表达，则克隆菌呈白色。
如果没插入MCS位点，而是自连的话，LAZ基因能表达，表达后产物与X-gal产生反应，变成蓝色蓝色。

T载体由于制作的问题，是会有自连得。如果没有自连的话 ，转入细菌，抗生素基因不能表达，细菌就不能在有抗生素的平板上生长。那么就不会产生菌落，产生了菌落的都是含有环形质粒的。

至于T载体为什么会自连，可以看下T载体是怎么生产的，一般都是用Eco5酶切出平末端，然后再平末端上加T尾，加T尾的效率并不是百分百的。
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8楼2011-03-07 11:56:19
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sxxuan

金虫 (著名写手)
★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
最近正在用这个载体，同样出现假阳性高的现象。
支持一下楼主，求解～
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2楼2011-03-07 10:12:02
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2011-03-07 10:12:02:
最近正在用这个载体，同样出现假阳性高的现象。
支持一下楼主，求解～

谢谢啦
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3楼2011-03-07 10:52:10
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yucheng9255

木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
看天(金币+5): 鼓励回答！ 2011-03-07 11:21:08
如果你们清楚T载体是怎么做出来的，就知道兰斑怎么来的了。

如果真的是两端都是T头，这个T载体是无法自连起来的。

但是为什么会有自连呢？是因为在制作T载体的过程中，除了两头是T的情况，不可避免的会还有一头是T突出，一头是平端（这个残留，但是也无法自连），或者两头是平端，或者是一头是T头，一头是A头，或者干脆就是微量的原始环状质粒无法完全分开，微量的环状原始质粒混在线性T载体成品里面。除了第一种情况一头T头，一头平端无法连接。其它几种情况加连接酶连接后，都会表现出环状的质粒，也就是蓝斑点了。至于为什么会混杂这几种东西，就牵涉到了基础的原理，和方法了，自己去查资料吧。

做T载体的工艺，就是尽可能的做到，全部是两头T头的载体，这样理论上就不会有篮斑了。但是这是不可能的，总会混杂上面几种情况造成蓝斑。混杂越多，蓝斑比例越多。也就是说明了T载体质量越差。这个是判断T载体好坏的一个最重要指标之一。

加T和酶切T载体的方法，没有可能达到100%不混杂上面几种情况。但是本公司做的T载体工艺，蓝色斑点小于10%，很多情况下小于5%，质量已经是达到顶级水平。其它公司很多工艺无法达到，就会出现较多的篮斑，或者两边T头掉了后，两端成了平端破坏读码框自连成白斑的假阳性情况。
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4楼2011-03-07 11:19:54
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198612楼
2011-03-07 12:48   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
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