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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)


[交流] 【求助/交流】pGEM-T Easy载体 T-A 连接 为啥没连入PCR产物的 菌斑是蓝斑

T载体如果不跟PCR产物连接, 不是由于T末端,自己不能自连吗? 这样不应该lacZ基因中间断裂 不能表达吗? 为什么没有连接PCR产物的菌班是蓝色的呢?
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tangbohejin

木虫之王 (文学泰斗)



xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-03-07 11:56:19:
建议楼主好好看看蓝白斑的基本原理~~~~~~~
如果PCR产物插入了MCS位点,则LAZ基因被截断,不能表达,则克隆菌呈白色。
如果没插入MCS位点,而是自连的话,LAZ基因能表达,表达后产物与X-gal产生反应,变成蓝色蓝 ...

顶---
16楼2011-03-08 12:16:57
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查看全部 24 个回答

sxxuan

金虫 (著名写手)



xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
最近正在用这个载体,同样出现假阳性高的现象。
支持一下楼主,求解~
2楼2011-03-07 10:12:02
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xnbioinfor

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
Originally posted by sxxuan at 2011-03-07 10:12:02:
最近正在用这个载体,同样出现假阳性高的现象。
支持一下楼主,求解~

谢谢啦
3楼2011-03-07 10:52:10
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yucheng9255

木虫 (著名写手)


★ ★ ★ ★ ★ ★
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
看天(金币+5): 鼓励回答! 2011-03-07 11:21:08
如果你们清楚T载体是怎么做出来的,就知道兰斑怎么来的了。

如果真的是两端都是T头,这个T载体是无法自连起来的。

但是为什么会有自连呢?是因为在制作T载体的过程中,除了两头是T的情况,不可避免的会还有一头是T突出,一头是平端(这个残留,但是也无法自连),或者两头是平端,或者是一头是T头,一头是A头,或者干脆就是微量的原始环状质粒无法完全分开,微量的环状原始质粒混在线性T载体成品里面。除了第一种情况一头T头,一头平端无法连接。其它几种情况加连接酶连接后,都会表现出环状的质粒,也就是蓝斑点了。至于为什么会混杂这几种东西,就牵涉到了基础的原理,和方法了,自己去查资料吧。

做T载体的工艺,就是尽可能的做到,全部是两头T头的载体,这样理论上就不会有篮斑了。但是这是不可能的,总会混杂上面几种情况造成蓝斑。混杂越多,蓝斑比例越多。也就是说明了T载体质量越差。这个是判断T载体好坏的一个最重要指标之一。

加T和酶切T载体的方法,没有可能达到100%不混杂上面几种情况。但是本公司做的T载体工艺,蓝色斑点小于10%,很多情况下小于5%,质量已经是达到顶级水平。其它公司很多工艺无法达到,就会出现较多的篮斑,或者两边T头掉了后,两端成了平端破坏读码框自连成白斑的假阳性情况。
4楼2011-03-07 11:19:54
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198612楼
2011-03-07 12:48   回复  
xnbioinfor(金币+1):谢谢参与
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