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[求助]
complement experiment 相关问题
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我想做complement experiment，现在已经得到重组质粒，将临床分离的突变菌株做成感受态，用化学转化的方法。 但是我的菌株本来就有很高的耐药性，将PGEM-T Easy（amp 抗性）和目的基因的重组质粒转进去后没办法筛选。 我尝试用蓝白筛选，稀释很多倍，但是得到的全是蓝色的菌台，都连在一起，根本没有单菌落，再进一步稀释怕把仅有的但菌落遗漏，导致现在是否转化成功都不清楚 请高手指点，谢谢 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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天使托
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T.Shen
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 耐药性可以作为快速筛选的方法，楼下说的有道理。 2011-06-22 15:18:26
西瓜: 考核存档 2011-06-22 15:20:04
475502411(金币+8): 2011-06-22 15:53:05
475502411(金币+4): 2011-07-04 22:13:14
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 耐药性可以作为快速筛选的方法，楼下说的有道理。 2011-06-22 15:18:26
西瓜: 考核存档 2011-06-22 15:20:04
475502411(金币+8): 2011-06-22 15:53:05
475502411(金币+4): 2011-07-04 22:13:14
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1：首先确定你的重组载体没有什么问题，如果有问题，那么就不能继续往下进行实验了； 2：做互补实验跟你的菌株耐药性没有什么关系。。。你将重组载体转化进去，为什么还要进行蓝白斑筛选呢？蓝白筛选理应在你验证是否连接上的时候才要进行的吧？一般如果你将目的基因成功连接至载体上的时候，做互补只需要将重组载体转化至突变体中，看看表型有没有回复至野生型就可以了，当然了，转化后你只需要提取质粒验证就可以了； 3：顺便说说对照怎么做吧，首先1号：PGEM-T Easy空载体转化进野生型； 2号：PGEM-T Easy空载体转化进突变体菌株； 3号：重组载体转化进突变株； 4号：重组载体转化进野生型（当然这个可能是多余，但是如果做互补的话，顺便带一个这个，看看你这个基因过量表达的话对菌的表型有什么影响未尝不可呢？有些基因确实是补不回去，可是过表达它就会有意想不到的表型的）； 4：其实做互补就是将目的基因连接至一个过量表达的载体上然后转化进突变株中，看看表型可以恢复不？过表达的载体很多，PJN105 PUC系列等等。。。 祝好运！  |
2楼2011-06-22 10:03:14
yuxia82012
木虫 (著名写手)
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zboter
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