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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » complement experiment 相关问题
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475502411

铜虫 (著名写手)

[求助] complement experiment 相关问题

我想做complement experiment，现在已经得到重组质粒，将临床分离的突变菌株做成感受态，用化学转化的方法。
但是我的菌株本来就有很高的耐药性，将PGEM-T Easy（amp 抗性）和目的基因的重组质粒转进去后没办法筛选。
我尝试用蓝白筛选，稀释很多倍，但是得到的全是蓝色的菌台，都连在一起，根本没有单菌落，再进一步稀释怕把仅有的但菌落遗漏，导致现在是否转化成功都不清楚
请高手指点，谢谢
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
1楼2011-06-22 09:26:11
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good! 耐药性可以作为快速筛选的方法，楼下说的有道理。 2011-06-22 15:18:26
西瓜: 考核存档 2011-06-22 15:20:04
475502411(金币+8): 2011-06-22 15:53:05
475502411(金币+4): 2011-07-04 22:13:14
1：首先确定你的重组载体没有什么问题，如果有问题，那么就不能继续往下进行实验了；
2：做互补实验跟你的菌株耐药性没有什么关系。。。你将重组载体转化进去，为什么还要进行蓝白斑筛选呢？蓝白筛选理应在你验证是否连接上的时候才要进行的吧？一般如果你将目的基因成功连接至载体上的时候，做互补只需要将重组载体转化至突变体中，看看表型有没有回复至野生型就可以了，当然了，转化后你只需要提取质粒验证就可以了；
3：顺便说说对照怎么做吧，首先1号：PGEM-T Easy空载体转化进野生型；
                             2号：PGEM-T Easy空载体转化进突变体菌株；
                             3号：重组载体转化进突变株；
                             4号：重组载体转化进野生型（当然这个可能是多余，但是如果做互补的话，顺便带一个这个，看看你这个基因过量表达的话对菌的表型有什么影响未尝不可呢？有些基因确实是补不回去，可是过表达它就会有意想不到的表型的）；

4：其实做互补就是将目的基因连接至一个过量表达的载体上然后转化进突变株中，看看表型可以恢复不？过表达的载体很多，PJN105 PUC系列等等。。。

祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
2楼2011-06-22 10:03:14
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): Amp就是氨苄青霉素（ampicillin）啦。我也觉得应该换别种抗性的载体。 2011-06-22 15:19:52
475502411(金币+1): 2011-06-22 15:52:56
475502411(金币+2): 2011-07-04 22:13:06
你说的耐药性本身就是抗氨苄青霉素的吗？这样子的话最好另外寻找带合适抗性的载体来做，蓝白斑本身也不是那么灵敏
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在等待中涅槃重生
3楼2011-06-22 12:06:37
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-06-22 10:03:14:
1：首先确定你的重组载体没有什么问题，如果有问题，那么就不能继续往下进行实验了；
2：做互补实验跟你的菌株耐药性没有什么关系。。。你将重组载体转化进去，为什么还要进行蓝白斑筛选呢？蓝白筛选理应在你验证 ...

谢谢！真的好厉害啊！
我现在已经连接成功
但往突变菌株中转化后不知道怎么筛选，因为我的突变菌株的耐药性很高，对氨苄和卡那的MIC都达到了512，我用蓝白筛选是为了 检测转化子，因为用要搬筛选已经行不通了
目前的困惑在于用蓝白筛选时，转化子较少，细胞浓度大，导致整个板上没单菌落，并且全是蓝色
苦脑，求助
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
4楼2011-06-22 15:59:35
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475502411

铜虫 (著名写手)
西瓜: 可以补充到1楼。 2011-06-22 21:45:42
引用回帖:
Originally posted by yuxia82012 at 2011-06-22 12:06:37:
你说的耐药性本身就是抗氨苄青霉素的吗？这样子的话最好另外寻找带合适抗性的载体来做，蓝白斑本身也不是那么灵敏

是的，并且MIC达到512，这株菌是临床突变菌株，各类药物的耐药水平都很高，帮忙看看吧，各药物的MIC在附件
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2011-06-22 16:16:19
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zboter

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励应助 2011-06-22 21:47:31
475502411(金币+3): 2011-06-22 21:57:02
475502411(金币+2): 2011-07-04 22:12:53
你好，你可以进行稀释，然后取一定量的菌液多涂上几块板子。现在的抗性筛选已经不管用了，必须使用蓝白筛选，祝好运，就是工作量大点，但是我觉得还是有希望的。
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6楼2011-06-22 21:01:16
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475502411

铜虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zboter at 2011-06-22 21:01:16:
你好，你可以进行稀释，然后取一定量的菌液多涂上几块板子。现在的抗性筛选已经不管用了，必须使用蓝白筛选，祝好运，就是工作量大点，但是我觉得还是有希望的。

是啊，我有考虑过这样做，但是我计算了一下，我之前往DH5a中转的时候，质粒是5微升，感受态是100微升，等到的转化子大概是300个。如果我这样计算，稀释100倍板上才可能是3个转化子。我上次做时稀释了10倍，但是没能得到单菌落，整个班全是蓝色。所以感觉有点忐忑，但目前只有这个办法了，试试吧，谢谢！
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
7楼2011-06-22 21:54:15
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475502411

铜虫 (著名写手)
我还有个想法，不知道能不能行得通，PGEM-T Easy载体的Amp抗性会不会能达到512呢？如果这样就可以提高药板的浓度筛选
因为我看过一篇报道（质粒载体pUC19在头孢哌酮抗性基因(CPZr)克隆中的应用探讨），载体的转入使DH5a的Amp抗性>256
这篇文章的word板上传，和大家分享
希望这能是我实验的一个出路！！！！
希望各位给我的实验给予更多的帮助，让我少走弯路
谢谢大家！
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
8楼2011-06-22 22:08:01
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