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qurande金虫 (小有名气)
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[求助]
129bp小片段从pGEM-T上酶切回收的问题
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129bp的小片段连接到pGEM-T载体上之后，菌落pcr鉴定条带正确，测序序列正确并且专门在测序结果中search过引物序列也正确 酶切体系 质粒 12ul(大约100ng/ul) bufferD 2.5ul nde1 0.9ul （promega的内切酶） sal1 0.9ul 补水到25ul 37度 4h 做两管反应，浓缩 然后跑2%的琼脂糖胶 两管酶切产物在一个胶空里跑电泳 当100bp的marker能分清条带的时候，却看不见目的条带 后来我有小量的双酶切试了试，质粒3ul ，内切酶分别用0.2ul，10ul体系酶切2h，还是没有出现目的条带 希望高手给出指点啊 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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terry130
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4楼2011-06-01 09:13:23
beautybanana
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2楼2011-06-01 08:51:31
terry130
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
qurande(金币+1): 谢谢你的建议 2011-06-01 12:07:01
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:23
qurande(金币+1): 谢谢你的建议 2011-06-01 12:07:01
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:23
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首先，小片段在胶里的染色信号要弱一些，有可能看不到，建议不要在配胶的时候加EB，而是电泳结束后用EB去染。 其次，你在大切前是应该做小切去确定酶切条件的，先大切失败然后想到小切是满痛的一个教训，你老板知道估计要发飙吧。 最后，小切验证是要有很多control的，这样才便于分析，同时切你自己的样品和别人的已经酶切成功过的样品作为对比，切的时候除了双切之外还要分别做单切，跑胶的时候每个样品都有四个lane分别是切前，单切，单切，双切，这样才能分析出问题出在哪里。 还有有的时候某个公司的酶针对某个载体就是不好用，那不妨换另一个公司的试试，我们实验室常用的酶都是有好几个公司的stock的。 |
3楼2011-06-01 09:12:28
空谷幽风
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
qurande(金币+5): 说的很到位谢谢 2011-06-01 12:06:40
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:38
qurande(金币+5): 说的很到位谢谢 2011-06-01 12:06:40
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:38
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看不到条带很正常，原因如下： 1.PGEM-T载体的分子量约为3000bp，你的片段为130bp左右，那么载体和片段的分子量之比是23:1。 2.你酶切时质粒的量约为1200ng，即1.2ug，不知道这个浓度是你测的还是估算的，保守点的话在1ug左右 3.假定EB显色的机理你都明白，那么酶切完跑胶后片段的亮度应为载体亮度的二十三分之一，片段的质量约为1000/23约为40ng，其实加上其他的一些损失误差之类的，很可能到不了这个量 4.你用的mark每条带都有一个浓度，乘上你加的体积就算这条带出质量了 建议：1.小片段直接用引物扩增后使用，尽量不要通过酶切来获得，即使跑胶能看到，回收效率也很低，这个你该懂 2.如果执意要酶切获得，只有多切些质粒 |
5楼2011-06-01 10:14:00
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