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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
qurande(金币+1): 谢谢你的建议 2011-06-01 12:07:01
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:23
首先,小片段在胶里的染色信号要弱一些,有可能看不到,建议不要在配胶的时候加EB,而是电泳结束后用EB去染。
其次,你在大切前是应该做小切去确定酶切条件的,先大切失败然后想到小切是满痛的一个教训,你老板知道估计要发飙吧。
最后,小切验证是要有很多control的,这样才便于分析,同时切你自己的样品和别人的已经酶切成功过的样品作为对比,切的时候除了双切之外还要分别做单切,跑胶的时候每个样品都有四个lane分别是切前,单切,单切,双切,这样才能分析出问题出在哪里。
还有有的时候某个公司的酶针对某个载体就是不好用,那不妨换另一个公司的试试,我们实验室常用的酶都是有好几个公司的stock的。
摒气动方息,宁神心自明。
3楼2011-06-01 09:12:28
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智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
qurande(金币+5): 说的很到位谢谢 2011-06-01 12:06:40
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:38
看不到条带很正常,原因如下:
1.PGEM-T载体的分子量约为3000bp,你的片段为130bp左右,那么载体和片段的分子量之比是23:1。
2.你酶切时质粒的量约为1200ng,即1.2ug,不知道这个浓度是你测的还是估算的,保守点的话在1ug左右
3.假定EB显色的机理你都明白,那么酶切完跑胶后片段的亮度应为载体亮度的二十三分之一,片段的质量约为1000/23约为40ng,其实加上其他的一些损失误差之类的,很可能到不了这个量
4.你用的mark每条带都有一个浓度,乘上你加的体积就算这条带出质量了
建议:1.小片段直接用引物扩增后使用,尽量不要通过酶切来获得,即使跑胶能看到,回收效率也很低,这个你该懂
2.如果执意要酶切获得,只有多切些质粒
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5楼2011-06-01 10:14:00
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