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qurande

金虫 (小有名气)

[求助] 129bp小片段从pGEM-T上酶切回收的问题

129bp的小片段连接到pGEM-T载体上之后，菌落pcr鉴定条带正确，测序序列正确并且专门在测序结果中search过引物序列也正确

酶切体系  质粒          12ul(大约100ng/ul)
           bufferD           2.5ul
             nde1             0.9ul     （promega的内切酶）
               sal1             0.9ul  
            补水到25ul    37度  4h   做两管反应，浓缩

然后跑2%的琼脂糖胶 两管酶切产物在一个胶空里跑电泳  当100bp的marker能分清条带的时候，却看不见目的条带

后来我有小量的双酶切试了试，质粒3ul ，内切酶分别用0.2ul，10ul体系酶切2h，还是没有出现目的条带
希望高手给出指点啊
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1楼 2011-06-01 08:42:01
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-06-02 09:10:10
引用回帖:
Originally posted by qurande at 2011-06-01 08:42:01:
129bp的小片段连接到pGEM-T载体上之后，菌落pcr鉴定条带正确，测序序列正确并且专门在测序结果中search过引物序列也正确

酶切体系  质粒          12ul(大约100ng/ul)
           bufferD           2.5ul
...

先把链接的载体电泳下看看有没有连接上（以pGEM-T载体为对照）连接上了说明就是酶切的问题，先把第一步确认好再说，连接上了，那就再调整酶切体系~PCR正确只是确定你扩增到了目的片段，但你连接的问题还没有确定~
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2楼2011-06-01 08:51:31
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
qurande(金币+1): 谢谢你的建议 2011-06-01 12:07:01
dhd997(金币+3, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:23
首先，小片段在胶里的染色信号要弱一些，有可能看不到，建议不要在配胶的时候加EB，而是电泳结束后用EB去染。
其次，你在大切前是应该做小切去确定酶切条件的，先大切失败然后想到小切是满痛的一个教训，你老板知道估计要发飙吧。
最后，小切验证是要有很多control的，这样才便于分析，同时切你自己的样品和别人的已经酶切成功过的样品作为对比，切的时候除了双切之外还要分别做单切，跑胶的时候每个样品都有四个lane分别是切前，单切，单切，双切，这样才能分析出问题出在哪里。
还有有的时候某个公司的酶针对某个载体就是不好用，那不妨换另一个公司的试试，我们实验室常用的酶都是有好几个公司的stock的。
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摒气动方息，宁神心自明。
3楼2011-06-01 09:12:28
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terry130

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

忘记说了，小切的话你用3ul有点少，至少要保证0.5mg，这样电泳才能看到带
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摒气动方息，宁神心自明。
4楼2011-06-01 09:13:23
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
qurande(金币+5): 说的很到位谢谢 2011-06-01 12:06:40
dhd997(金币+5, EPI+1): good 2011-06-02 09:10:38
看不到条带很正常，原因如下：
1.PGEM-T载体的分子量约为3000bp，你的片段为130bp左右，那么载体和片段的分子量之比是23:1。
2.你酶切时质粒的量约为1200ng，即1.2ug，不知道这个浓度是你测的还是估算的，保守点的话在1ug左右
3.假定EB显色的机理你都明白，那么酶切完跑胶后片段的亮度应为载体亮度的二十三分之一，片段的质量约为1000/23约为40ng，其实加上其他的一些损失误差之类的，很可能到不了这个量
4.你用的mark每条带都有一个浓度，乘上你加的体积就算这条带出质量了
建议：1.小片段直接用引物扩增后使用，尽量不要通过酶切来获得，即使跑胶能看到，回收效率也很低，这个你该懂
2.如果执意要酶切获得，只有多切些质粒
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5楼2011-06-01 10:14:00
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qurande

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-06-01 10:14:00:
看不到条带很正常，原因如下：
1.PGEM-T载体的分子量约为3000bp，你的片段为130bp左右，那么载体和片段的分子量之比是23:1。
2.你酶切时质粒的量约为1200ng，即1.2ug，不知道这个浓度是你测的还是估算的，保守点 ...

小片段直接用引物扩增后使用 怎么使用啊，我要连接另一个载体，需要粘性末端，另外，pcr产物我直接双酶切   连载体没有成功，上网查到说是我用的两个酶不仅仅需要它专用的酶切位点，还需要一段酶切位点前面的序列来帮助内切酶作用到酶切位点上去
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6楼2011-06-01 10:32:46
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流 2011-06-08 18:56:33
引用回帖:
Originally posted by qurande at 2011-06-01 10:32:46:
小片段直接用引物扩增后使用 怎么使用啊，我要连接另一个载体，需要粘性末端，另外，pcr产物我直接双酶切   连载体没有成功，上网查到说是我用的两个酶不仅仅需要它专用的酶切位点，还需要一段酶切位点前面的序 ...

要发生酶切，需要在酶切位点前面加上适当数目的保护碱基，常用的酶一般有3个保护碱基就够了，但是考虑到pcr的时候容易在两端发生碱基的丢失，所以我习惯添加5个保护碱基。所以你的引物的5‘端要在酶切位点前面加上保护碱基后去扩增片段，扩完后就可以酶切使用了
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7楼2011-06-01 10:56:07
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qurande

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-06-01 10:56:07:
要发生酶切，需要在酶切位点前面加上适当数目的保护碱基，常用的酶一般有3个保护碱基就够了，但是考虑到pcr的时候容易在两端发生碱基的丢失，所以我习惯添加5个保护碱基。所以你的引物的5‘端要在酶切位点前面 ...

pcr产物酶切完毕需要纯化或者跑胶切胶回收么？
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8楼2011-06-01 11:54:00
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qurande

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-06-01 10:56:07:
要发生酶切，需要在酶切位点前面加上适当数目的保护碱基，常用的酶一般有3个保护碱基就够了，但是考虑到pcr的时候容易在两端发生碱基的丢失，所以我习惯添加5个保护碱基。所以你的引物的5‘端要在酶切位点前面 ...

悲剧了，我选的两个酶上游nde1  下游 sal1 都需要很长的保护碱基，我的都只有3个啊~~~
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9楼2011-06-01 12:11:38
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qurande at 2011-06-01 12:11:38:
悲剧了，我选的两个酶上游nde1  下游 sal1 都需要很长的保护碱基，我的都只有3个啊~~~



重新设计引物吧，或者酶切的时候多加些质粒
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10楼2011-06-01 22:05:16
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