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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 129bp小片段从pGEM-T上酶切回收的问题
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terry130

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 牛人啊！ 2011-06-08 18:57:15
引用回帖:
Originally posted by qurande at 2011-06-01 12:11:38:
悲剧了，我选的两个酶上游nde1  下游 sal1 都需要很长的保护碱基，我的都只有3个啊~~~



你也可以尝试另一种方案，设计引物的时候只加酶切位点，然后PCR 产物直接连到T载体中，之后再切T载体，这样就不用加保护碱基了
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摒气动方息，宁神心自明。
11楼2011-06-03 15:59:24
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qurande

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by terry130 at 2011-06-03 15:59:24:
你也可以尝试另一种方案，设计引物的时候只加酶切位点，然后PCR 产物直接连到T载体中，之后再切T载体，这样就不用加保护碱基了

谢谢啊，我已经连好t载体了，困难的是从t上切下来回收比较困难
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12楼2011-06-03 19:06:22
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★ ★ ★
西瓜(金币+3): 鼓励交流，有道理！ 2011-06-08 18:57:43
要是我做，我宁愿PCR回收，载体和片段比例太悬殊了，要回收一定浓度的目的片段得切多少重组质粒啊。
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Thank-you，so-blue.
13楼2011-06-08 16:27:38
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terry130

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by qurande at 2011-06-03 19:06:22:
谢谢啊，我已经连好t载体了，困难的是从t上切下来回收比较困难

12L说的有道理，你这个片段是有点小，不过连到T载体上还是比用保护碱基好些，这样你可以在T载体两个酶切位点上游和下游大数百bp的位置设计一对引物来PCR，这样产物也就几百bp，做4个50ul的体系产量就够你去酶切了，这比切几千bp的T载体要好，产率高一些，内切酶也节省很多。之前在商品化的质粒中切200bp左右的shRNA片段时就是用的这种方法，也是说明书中推荐的方案。
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摒气动方息，宁神心自明。
14楼2011-06-09 07:27:58
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