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新虫 (小有名气)

[交流] 如何做分步双酶切 已有6人参与

第一个酶切完跑胶回收?那岂不是浓度会很降低?不跑胶回收的话,热失活完直接加第二种酶?那与之对应的buffer怎么加呢?请赐教!!!!越详细越好!!!!
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七魂0330

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 因为吃饭 at 2013-09-11 08:25:26
我最近刚做的双酶切,因为有种酶没有了,订货要很久,就换了另外一个公司的,但是buffer不一样,也是分开切的。我就是第一次切完,然后用试剂盒纯化,再做第二次酶切,然后再切胶回收。

请问用的什么试剂盒纯化?
5楼2014-10-06 15:20:34
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查看全部 7 个回答

xiaopeiliang

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
第一个酶切完之后,用酚和氯仿抽提 ;
醇沉
风干后再第二个酶切
2楼2013-09-10 22:32:09
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ykluuniu

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-11 11:48:26
1.明确你酶切的是什么。载体?还是PCR产物?
载体:酚/氯仿抽提或核酸纯化试剂盒回收,这样回收效率应该比胶回收高。然后再进行下一步单酶切,纯化试剂盒或胶回收。
PCR产物:跑胶,若无二聚体,核酸纯化试剂盒回收比较好,当然,无论有无二聚体,胶回收肯定都没有问题。然后,分步单酶切与载体相同操作,酚/氯仿或试剂盒。纯化试剂盒一定要注意,要弄清楚能回收多大的片段。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]

[ Last edited by ykluuniu on 2013-9-10 at 22:56 ]
3楼2013-09-10 22:54:49
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因为吃饭

银虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-11 11:48:31
我最近刚做的双酶切,因为有种酶没有了,订货要很久,就换了另外一个公司的,但是buffer不一样,也是分开切的。我就是第一次切完,然后用试剂盒纯化,再做第二次酶切,然后再切胶回收。
辩证。
4楼2013-09-11 08:25:26
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