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tubulifera

木虫 (正式写手)

[求助] reverse PCR 线性化载体 已有3人参与

大家好,有谁用过clontech公司的Infusion cloning kit的,我用reverse PCR 对大小为10kb的载体线性化,然后与一个800bp的片段连接,在平板上也长了单菌落,但是测序发现,片段插入的位置不对,有些克隆与原载体比少了很多。请求大家给予帮助,是用PCR线性化的问题吗?还是其他的问题。在此先表示感谢!!
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陌路行客

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,分子生物期待你更多精彩。 2014-10-09 14:04:48
确定是单酶切位点吗?
人生中的悲剧太多了
2楼2014-10-09 08:16:00
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
聚合酶有时也有外切酶活性

[ 发自小木虫客户端 ]
3楼2014-10-09 20:06:21
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tubulifera

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 陌路行客 at 2014-10-09 08:16:00
确定是单酶切位点吗?

没有酶切位点,我才选择用reverse PCR线性化,如果有酶切位点的话我就直接用酶切了。谢谢你的回复!
4楼2014-10-10 09:04:32
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tubulifera

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by bio_sci at 2014-10-09 20:06:21
聚合酶有时也有外切酶活性

谢谢你的回复,你说的是在进行infusion PCR的时候切掉了然后重组?但我得到的每一个clones都能PCR检测到我的目的片段。
5楼2014-10-10 10:38:41
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neoandkidd

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

是不是引物设计错了,一个基因infuaion很容易做的啊。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
新起点
6楼2014-10-15 06:15:27
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tubulifera

木虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by neoandkidd at 2014-10-15 06:15:27
是不是引物设计错了,一个基因infuaion很容易做的啊。

引物我让几个经常做INFUSION的实验室帮着看了,发现引物没有问题。谢谢!
7楼2014-10-18 15:56:56
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