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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 毕赤酵母电击转化ppic9k线性化
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)

[求助] 毕赤酵母电击转化ppic9k线性化 已有2人参与

ppic9k上面有两个Bgl ii ,为什么线性化的时候可以选择这个酶，切的时候就切成两段啦，回收的时候回收哪段哪？
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1楼 2014-06-03 20:44:42
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-03 22:26:54
bglII是用来在体外做串联表达盒用的，本职作用并不是线性化的位点。
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稻草人的学习
大家相互帮助哈
3楼2014-06-03 21:42:24
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 李小同 at 2014-06-03 21:02:51
Invitrogen的说明书上，9K是只能用SAC I或者SAL I线性化的啊

那你线性化过后是用胶回收的还是用试剂盒纯化的啊？线性化的体系用的是什么养的哪？
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5楼2014-06-05 18:00:57
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普通回帖

李小同

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2014-06-03 22:26:48
Invitrogen的说明书上，9K是只能用SAC I或者SAL I线性化的啊
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稻草人的学习
2楼2014-06-03 21:02:51
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 李小同 at 2014-06-03 21:02:51
Invitrogen的说明书上，9K是只能用SAC I或者SAL I线性化的啊

谢谢
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4楼2014-06-05 17:59:28
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by luwei13566 at 2014-06-03 21:42:24
bglII是用来在体外做串联表达盒用的，本职作用并不是线性化的位点。

谢谢
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6楼2014-06-05 18:01:09
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李小同

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 稻草人的学习 at 2014-06-05 18:00:57
那你线性化过后是用胶回收的还是用试剂盒纯化的啊？线性化的体系用的是什么养的哪？...

当然是乙醇沉淀啊，不用试剂盒~~线性化体系就跟平常酶切的体系一样的，按照你用的酶的说明书就OK了~~
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7楼2014-06-11 16:57:59
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luwei13566

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 稻草人的学习 at 2014-06-05 18:00:57
那你线性化过后是用胶回收的还是用试剂盒纯化的啊？线性化的体系用的是什么养的哪？...

可有直接用好一些的产物纯化试剂盒，纯化的浓度尽可能的高。洗脱最好用ddH2O来洗脱。也可以用乙醇沉淀，但是如果你线性化后的DNA太少沉淀后很可能你就看不到沉淀导致后面乙醇漂洗操作不小心就把你的DNA给漂洗掉了。
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8楼2014-06-11 23:17:09
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xiaoyue0453

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 李小同 at 2014-06-11 16:57:59
当然是乙醇沉淀啊，不用试剂盒~~线性化体系就跟平常酶切的体系一样的，按照你用的酶的说明书就OK了~~...

你好，我是设计双酶切位点（EoRI,NotI），先在大肠里将目的基因与pPICZaB载体构建好重组质粒，将质粒用EoRI酶单酶切后，用OMEGA cycle kit回收后电击毕赤酵母，涂的平板是带50ug/ml zeocin的YPD平板，是不是平板上长出来的就是带有目的基因的阳性菌呢？我随机挑长出来的单克隆接种到5ml YPD（加50ug/ml zeocin）中却长不起来；另外，线性化的质粒电击后是整合到酵母基因组中，那提酵母的质粒能提到吗，我试着挑单克隆接种到YPD中（忘了加抗生素），菌能长出，将提取的质粒做PCR,居然能P出目的条带，但将该菌接种到加有抗生素的YPD中便长不出来，请问有高手知道原因吗？
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9楼2014-06-20 10:36:37
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
2楼: Originally posted by 李小同 at 2014-06-03 21:02:51
Invitrogen的说明书上，9K是只能用SAC I或者SAL I线性化的啊

前辈，如果用Bgl II 酶切呢？
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10楼2018-05-25 09:35:55
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